M1型巨噬细胞相关因子在重度慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达及其意义

蔡如佳，关 宁，刘乙臻，高秀秋，王琳源

(1.锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室，辽宁 锦州 121000)

慢性牙周炎是一种由牙周菌斑微生物引发的炎症性、破坏性疾病，是我国成年人牙齿缺失的主要原因[1]，也是心血管疾病、糖尿病和类风湿性关节炎等疾病的重要危险因素[2]。目前临床上治疗慢性牙周炎主要采用牙周基础治疗和手术治疗，但因其病情长期存在，有部分患者经治疗后牙周组织仍然存在炎症，要取得根治的效果相对困难。因此，研究慢性牙周炎发生发展的相关机制，寻找有力的治疗手段是目前亟需解决的问题。近年来研究[3-4]显示：牙周炎的进展及严重程度与宿主自身免疫性炎症反应存在密切关联。当致病菌开始入侵牙周组织时，先天性免疫系统发挥宿主防御功能。牙周组织的先天免疫系统包括软组织屏障和免疫细胞。巨噬细胞作为宿主先天免疫的重要组成部分[5]，能够分泌单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等趋化因子，从而诱导更多的巨噬细胞在牙周组织中活化聚集，通过趋化因子产生和自我调节，建立防御机制。巨噬细胞还可以通过膜上的识别受体，识别微生物表面的病原相关分子，从而有效地吞噬病原微生物，进而在牙周炎的发生发展过程中发挥重要功能，维持牙周组织的稳态[6]。其中，M1型巨噬细胞作为巨噬细胞的一种亚型，具有黏附和杀伤细菌、分泌大量促炎因子及启动获得性免疫应答的作用[7]。但在重度慢性牙周炎的病损组织中M1型巨噬细胞的表现及其在发病过程中可能发挥的功能目前国内少见相关文献报道。本实验通过检测M1型巨噬细胞相关因子诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和信号传导及转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)在重度慢性牙周炎病损组织中的表达情况，探讨M1型巨噬细胞在重度慢性牙周炎中的作用，旨在为牙周炎的防治提供免疫理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂蛋白Marker(赛默飞公司，美国)，Anti-iNOS Antibody ab204017(Abcam公司，英国)，STAT1 Antibody(Cell Signaling公司，美国)，β-actin Antibody和Rabbit Anti-beta-Actin (Loading Control)(Bioss公司，中国)、PVDF膜(GE公司，美国)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和丽春红染色液(碧云天公司，中国)，HiScriptR Ⅱ One Step RT-PCR Kit(Vazyme公司，中国)，100 bp DNA Ladder Marker(大连TaKaRa公司，中国)，TRIzol(Ambion公司，中国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、iNOS和STAT1引物合成及DEPC水(北京鼎国昌盛生物科技有限公司，中国)。

1.2 样本采集和处理选择2017年12月—2018年5月就诊于锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科和口腔颌面外科的患者，收集15例重度慢性牙周炎患者的病损牙龈组织作为实验组，收集15例埋伏阻生需要拔除的患牙，取阻生牙冠方覆盖的健康牙龈组织作为健康对照组。所有入选的研究对象均满足研究要求的纳入和排出标准。本研究通过锦州医科大学附属口腔医院伦理委员会审查，所有研究对象均知情同意。实验组纳入标准参照文献[8]：探诊出血(bleeding on probing，BOP)阳性，牙周探诊深度(probing depth，PD)≥6 mm，附着丧失(attachment loss， AL)≥5 mm，X线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/2，甚至达到根长的2/3，后牙存在Ⅱ或Ⅲ度根分叉病变，需要≥2颗患牙具有以上特征；如仅有2颗患牙符合，则必须为不相邻患牙且位于不同象限。对照组纳入标准参照文献[9]：PD<3 mm，无AL，无牙槽骨吸收，BOP阴性，经临床和影像学(曲面断层)检查确诊为阻生智齿，且无明显的临床炎症，无盲袋形成。排除标准：①所有纳入对象均满足无全身系统性疾病；②吸烟或有吸烟史；③不满18岁；④有全身性疾病，如糖尿病和风湿性关节炎等；⑤妊娠或哺乳期；⑥6个月内进行牙周治疗或使用抗生素及漱口水等；⑦长期抗炎治疗，使用糖皮质激素和免疫抑制剂等。

1.3 RT-PCR法检测2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA表达水平①TRIzol法提取牙龈组织中的mRNA。先用PBS液清洗组织，后加入1 mL TRIzol试剂，用小剪刀尽量剪碎(在冰上操作)，用枪头反复吹打后室温放置5 min，然后加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置2～3 min，高速离心，4℃、12 000 r·min-1，离心15 min，吸取上层无色水相至新的EP管中(注意切勿吸到中层物质)，加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀后室温放置5 min，高速离心，4℃、12 000 r·min-1，离心10 min，尽量吸净上清液，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，震荡数次后，高速离心，4℃、12 000 r·min-1，离心5 min，尽量吸净乙醇保留沉淀，室温干燥2～5 min后加入30 μL DEPC水进行溶解，将EP管放到60℃水浴锅孵育5 min。②RNA浓度测定。取1 μL RNA样本，加入99 μL DEPC水，紫外分光光度计测量RNA浓度。③RT-PCR 反应。按照一步法反转录试剂盒配置25 μL 反应体系，加入反应体系中RNA的量约为300 ng。反转录得到的cDNA进行PCR扩增。引物设计：iNOS上游引物序列 5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′，下游引物序列 5′-GGCTGTCAGAGTCTTGTGCCTTTGG-3′，扩增目的基因片段长度为497 bp；STAT1上游引物序列 5′-AAGCAAGCGTAATCTTCAG-3′，下游引物序列 5′-GGTCTCGTGTTCTCTGTT-3′，扩增目的基因片段长度为298 bp；以β-actin为内参照，β-actin上游引物序列 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，扩增目的基因片段长度为285 bp。引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件为94℃、5 min；35个PCR循环(94℃、30 s，58℃、45 s，72℃、1 min)，最后72℃延伸7 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶分离，在凝胶成像系统内扫描后测量条带强度，以目标条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示iNOS和STAT1 mRNA表达水平。

1.4 Western blotting法检测2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 蛋白表达水平取出适量标本，室温融化，加入150 μL裂解液，反复吹打以充分裂解细胞，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，经蛋白定量后按照每孔20 μg上样，10%聚丙烯酰胺凝胶(10%SDS-PAGE)电泳并经湿式转膜、洗膜、封闭后，取一抗稀释液(TBST液)按照1∶1 000稀释iNOS和STAT1抗体，4℃摇床过夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀释的二抗，室温振摇孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法显色、曝光后测量X光胶片上条带灰度值，以β-actin进行标定，以目标条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示iNOS和STAT1蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA表达水平在对照组健康牙龈组织和实验组重度慢性牙周炎牙龈组织中，iNOS和STAT1均有不同程度的表达，且在实验组重度慢性牙周炎患者牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.01)。见图1和表1。

Lane 1: Control group;Lane 2: Experimental group.

图1 2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA表达电泳图

Fig.1 Electrophoregram of expressions of iNOS and STAT1 mRNA in gingiva tissue of patients in two groups

表1 2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA表达水平

GroupiNOSmRNASTAT1 mRNAContr ol0.290±0.5000.300±0.041Experimental0.970±0.145∗1.020±0.117∗

*P<0.01vscontrol group.

2.2 2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1蛋白表达水平在对照组健康牙龈组织和实验组重度慢性牙周炎牙龈组织中iNOS和STAT1蛋白均有不同程度的表达；实验组患者牙龈组织中iNOS和STAT1 蛋白表达水平高于对照组(P<0.01)。见图2和表2 。

Lane 1: Control group;Lane 2: Experimental group.

Fig.2 Electrophoregram of expressions of iNOS and STAT1 protein in gingiva tissue of patients in two groups

表2 2组患者牙龈组织中iNOS和STAT1蛋白表达水平

GroupiNOS proteinSTAT1 proteinControl0.160±0.6250.260±0.121Experimental0.890±0.084∗0.860±0.198∗

*P<0.01vscontrol group.

3 讨 论

慢性牙周炎是一种发生在牙齿支持组织的免疫炎症性疾病，可引起牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的破坏和吸收。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)作为牙周炎的主要致病菌，其侵袭牙周组织后能激活大量的炎症细胞[10]。JAGANNATHAN等[11]在慢性牙周炎患者的龈沟液中检测到大量的巨噬细胞浸润。有研究[12]显示:在重度牙周炎的病损组织中巨噬细胞大量聚集，破坏牙周组织基底膜层，使脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等内毒素进入牙龈组织，吸收入血后，持续刺激患者全身免疫反应，使患者体内炎症水平显著增高，表明巨噬细胞与牙周炎病变组织中的炎症反应密切相关。

巨噬细胞在外界不同的刺激下，可以发生不同方向的极化进而分化为具有不同表型和功能的巨噬细胞[13]。单核细胞在炎症因子的刺激下，通过STAT1途径，诱导生成经典的 M1 型巨噬细胞。M1型巨噬细胞表现出较强的促炎性，大量表达 IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α)和iNOS等，能激活机体免疫应答，加重炎症反应和组织损伤[14]。在IL-4和IL-10等刺激下，巨噬细胞分化为替代性活化的M2型巨噬细胞，进而发挥免疫调节和组织修复的作用[15]。GEMMELL等[16]研究发现：与正常健康的牙龈组织比较，慢性牙周炎患者牙龈组织中CD80阳性的M1型巨噬细胞浸润明显增加，并伴随B细胞和T细胞明显增加，表明M1型巨噬细胞能显著影响慢性牙周炎的发病过程。

牙龈卟啉单胞菌中的LPS与血清来源的LPS结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合后，激活Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)，是诱导M1型巨噬细胞形成的重要原因。激活的M1型巨噬细胞通过接头蛋白髓样分化因子(myeloid differentiation protein，MyD88)依赖的信号转导途径，激活核因子κB(nucler factor-κB,NF-κB)途径[17]，最终巨噬细胞通过无氧糖酵解途径释放大量iNOS。iNOS在机体中能够调节血管张力和微血管的通透性，诱导炎性细胞迁移并激发其氧化活性，进而起到抑制和杀灭病原微生物的作用[18]。iNOS不存在于非激活的巨噬细胞中，在LPS和IFN-γ诱导激活的M1型巨噬细胞中，可稳定测出iNOS活性以及mRNA和蛋白表达[19]。因此iNOS被认为是M1型巨噬细胞活化状态的标志物。

STAT1是一种能够与目的基因启动子结合的转录调控因子，在非受体型酪氨酸蛋白激酶(Janus kinase，JAK)的作用下，被磷酸化并发生二聚化，游离出来转位到细胞核内，作为转录因子，调控基因表达。STAT1主要参与调控病毒、细菌以及寄生虫感染的免疫激活、细胞分化和抑制细胞生长等生理过程。研究[20-21]显示：IFN-γ能够通过激活JAK-STAT1信号通路调控巨噬细胞极化。IFN-γ主要通过激活STAT1,增强巨噬细胞对病原菌的杀伤能力与抗原呈递能力，并加速一系列促炎细胞因子的分泌[22]。IFN-γ能诱导巨噬细胞向M1型极化，STAT1成为M1型巨噬细胞表型调节因素的一个关键环节。所以本文作者通过检测慢性牙周炎患者牙龈组织中M1型巨噬细胞相关因子STAT1 mRNA和蛋白表达水平，从而评价重度慢性牙周炎患者牙龈组织中巨噬细胞状态。

综上所述，在健康牙龈组织和重度慢性牙周炎牙龈组织中均存在M1型巨噬细胞标志物iNOS和相关因子STAT1的表达，并且重度慢性牙周炎组牙龈组织中iNOS和STAT1 mRNA和蛋白表达水平均明显高于健康牙龈组织，表明在重度慢性牙周炎中M1型巨噬细胞介导的免疫应答增强，M1型巨噬细胞参与牙周组织的炎症反应和组织损伤，为以iNOS和STAT1作为标志物评估慢性牙周炎的炎症进程提供借鉴。由于本研究受样本量以及检测方法限制，其相关M1型巨噬细胞在重度慢性牙周炎中的具体作用机制还需要大样本观察和实验进一步论证。