国医大师尼玛治疗藏医“青乃丹吾”病的用药规律研究和潜在靶点预测＊

仁增加，李啟恩，2，切羊让忠，彭毛东主，3，贡却坚赞，2＊＊

（1. 青海大学藏医学院 西宁 810000；2. 藏药新药开发国家重点实验室 西宁 810000；3. 青海省藏医院 西宁 810016）

“青乃丹吾”病是藏医学18种肝病之一，对应于现代医学疾病分类中的乙型肝炎（HBV）[1]，是引起肝硬化、肝细胞癌的主要因素之一[2]，据世界卫生组织报道，全球约20 亿人曾感染HBV，其中2.4 亿人为慢性HBV 感染者[3]，每年约有65 万人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌[4]。我国肝硬化和肝细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为60%和80%[5]。近年来藏医临床研究表明，藏药治疗乙型肝炎具有独特的疗效和临床价值[6]。

国医大师是当代名老中医的杰出代表，体现着当代中医学术和临床发展的最高水平[7]。藏医泰斗尼玛是青海省首位国医大师，也是全国名中医和中华非物质文化遗产传承人，现年88岁高龄仍供职于青海省藏医医院，依然坚持服务患者，已从事藏医临床工作63年，有着丰富的临床经验和独到的学术见解。其医案作为临床经验记录的载体，是分析和挖掘中医治疗有效性和实用性的科学依据[8]。因此本文以临床医案为切入点，运用数据挖掘方法分析国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的用药规律，探究其用药思想和经验处方背后的潜在特点，为藏医临床用药提供新的指导思想和理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

本研究的医案数据来源于国医大师尼玛传承工作室数据库，以治疗“青乃丹吾”病（乙型肝炎）的医案处方信息为研究对象，收集2014年1月3日-2016年5月23日期间在青海省藏医院诊治的门诊患者的有效病例资料，包括患者姓名、就诊时间、年龄、性别、藏医诊断、西医诊断、藏药处方等信息。

1.2 诊断标准

西医诊断以2015年中华医学会肝病学分会和感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》为依据。藏医诊断以《四部医典》记载的“青乃丹吾”病证候为依据。

1.3 纳入标准

①符合藏医“青乃丹吾”病的诊断标准；②西医诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》；③性别及年龄不限。

1.4 排除标准

①诊断不符合上述标准者；②患有严重的精神障碍和肿瘤患者等；③西药介入的医案。

1.5 研究方法与数据分析

从青海省藏医院共收集到510例国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的病历，依据排除标准整理和去重处理后，得到有效病历452 例，应用SPSS Modeler 18.0 和TBtools v0.66837 软件进行关联规则（Apriori）和层次聚类分析。应用BATMAN-TCM、Genecard、String、R语言等数据库和软件对高频藏药（药物频数≥50）进行生物信息学分析。

2 结果

2.1 一般资料

“青乃丹吾”病男性患者301 例，占患者总人数的66.6%，平均年龄（37±14.06）岁。女性患者151 例，占患者总人数的33.4%，平均年龄（34.22±14.68）岁。

2.2 方剂和药物频数

在国医大师治疗“青乃丹吾”病的104 首方剂中，使用频数≧23的藏药有方剂15首，药材15个，使用频数＞100 的方剂有6 首，从高到低依次是二十五味马宝丸（282 次）、七味红花殊胜散（235 次）、松石胶囊（233）、甘露月晶丸（214次）、十八味红花散（210次）和仁青芒交（164 次）。使用频数＞33 的药材有6种，从高到低依次为诃子（63 次）、川木香（53 次）、红花（50次）、豆蔻（38 次）、余甘子（37 次）、和肉豆蔻（34次）（表1）。

表1 国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病处方中用药频数≧23的方剂和药材

2.3 方剂和药材关联规则

运用SPSS Modeler 18.0软件中的Apriori算法对藏药方剂和药材进行关联规则分析，设置最小支持度为10%，方剂最小置信度为75%，药物最小置信度为80%，得到置信度最高的藏药方剂组合为二十五味马宝丸-十三味红花丸→松石胶囊，药材组合为余甘子-毛诃子→诃子（表2、图1）。

2.4 择时用药规律分析

藏医学根据时令、饮食、疾病性质、人的体质和年龄，以及隆、赤巴、培根“三因”的蓄、发、息期等因素，采取不同的服药方法，具有鲜明的择时用药特点，这一特点在国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的用药原则中尤为突出。本文将择时用药特点和方剂药性结合分析发现，国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病时清晨以解毒类方剂为主，早上以保肝类方剂为主，中午以清热除瘟类方剂为主，晚上以调隆舒肝类方剂为主，择时用药的药性以治疗赤巴为主，调隆为辅，降培根为次（图2）。

表2 国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的藏药方剂关联规则

图1 藏药方剂中高频药材之间的关联规则弦图

2.5 方剂功效分类

依据数据库中的104 首方剂，对全部方剂的功效参照文献进行分类统计，并应用cytoscape 3.7.2软件按度值大小构建“分类-方剂”的网络图，度值最高的前5类方剂分别是清热解毒药、温胃消食药、清肝热药、调和查隆药和驱虫药（图3）。

2.6 方剂药性聚类分析

选取频数≧12的方剂，依据藏医“味性化味”药性理论，参照《四部医典》《晶珠本草》《藏药晶镜本草》等经典著作整理每首方剂的组成药材、药味、剂量、药性等。绘制味和化味的频数分布（图4），并运用层次聚类分析法之中的组间平均法，区间采用Euclidean 距离，分析和构建国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病高频方剂的药性聚类图（图5）。结果发现，国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病高频方剂的味和化味均以苦和甘为主，药性以重、凉、钝为主。

2.7 高频药物治疗“青乃丹吾”病的潜在靶点预测

2.7.1 交集靶点与PPI蛋白互作网络的构建

将频数≥50 的诃子、木香、红花三味药输入到BATMAN-TCM 在线分析工具，将“Cutoff”值设为80，“AdjustP-value”设为0.01[9]，去重处理后得到364个靶点，与“Hepatitis B”为检索词在Genecards（https://www.genecards.org/）数据库设Relevance Score ＞7.5 获取的1411 个靶点，进行交集后得80 个基因。将80 个交集基因上传至String 数据库，物种选为Homo sapiens，评分条件设为0.4，然后利用cytoscape 软件构建作用靶点 互 作 网 络 图，显 示AKT1（degree = 42）、TNF（degree = 28）、JUN（degree = 25）的度值最高，推测这些靶点可能是治疗乙型肝炎的关键靶点（图6）。

2.7.2 GO功能和KEGG富集分析

利用perl 工具将80 个关键靶点转为entrez ID，然后以R 语言为平台，运用“clusterProfiler”程序包，利用Bioconductor 提供的GO 注释信息和KEGG pathway 数据库，以P＜0.05为条件，进行信号通路富集可视化分析[10]。GO 功能富集结果显示，其主要涉及辅因子结合（16个靶点）、羧酸结合（12个靶点）、有机酸结合（12个靶点）、核受体活动（11 个靶点）、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA结合（11个靶点）、类固醇激素受体活性（11个靶点）、类固醇结合（9个靶点）、血红素结合（9 个靶点）和四吡咯结合（9 个靶点）等生物学调控过程（图7）。

图2 藏医治疗“青乃丹吾”病择时用药规律树状图

KEGG 通路富集结果显示，其主要涉及Rap1 信号通路（11 个靶点）、鞘脂信号通路（9 个靶点）、ErbB 信号通路（10 个靶点）、HIF-1 信号通路（8 个靶点）、FoxO信号通路（8个靶点）、内分泌抵抗（7个靶点）和磷脂酶D 信号途径（7 个靶点）等，表明高频药物可能作用于这些通路达到治疗乙型肝炎的目的（图8）。

3 讨论

藏医学认为，“青乃丹吾”是精华未化和多摄味性相克之饮食，导致精华随糟粕混合入脉，瘟毒蓄积于肝脏而引起，其本质为陈旧热和瘟毒。方剂和药材频数分析发现，国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病使用次数最多的方剂中二十五味马宝丸（剂量1.0 g）和仁青芒觉（剂量1.0 g）具有清热解毒的作用，主治各类中毒症、陈旧热、木布等疾病。七味红花殊胜散（剂量0.9 g）和十八味红花散（剂量1.05 g）具有清热消炎、保肝退黄的功效，用于新旧性肝病，劳伤引起的肝血增盛和肝肿大。松石胶囊（剂量0.75 g）有清热解毒，疏肝利胆的功效，主治血瘀及热性肝病。甘露月晶丸（剂量1.2 g）主治肝毒症、木布等疾病。使用次数最多的单味药材诃子能平衡三因、减少药物的毒副作用，川木香、红花、豆蔻、余甘子等具有行隆保肝、清热凉血等功效。从关联度最强的核心方剂组合二十五味马宝丸-十三味红花丸→松石胶囊可以看出，国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病以解毒、清肝热、保肝为主进行治疗。核心单味药材余甘子-毛诃子→诃子组成的基础方在藏药中称之为“三果汤”，是藏医临床常用的加减方和药引剂，也是本次研究的23 例方剂的核心药材，具有调和气血、增强药性、减少毒副作用的功效。以上用药规律，体现了国医大师治疗“青乃丹吾”病的同时特别关注药物毒副作用的治疗原则。

图3 分类-方剂统计网络图

图4 高频方剂的味和化味频数条形图

图5 高频方剂的药性聚类图

图6 高频藏药治疗乙肝的PPI蛋白互作网络图

藏医的因时用药与现代时辰药理学的观点不谋而合，这既体现了藏医理论特色又符合疾病的发生与转归[11]。从择时用药规律分析发现，国医大师尼玛在实际用药时，清晨以二十五味马宝丸（n= 220）、仁青芒觉（n= 140）等治疗“青乃丹吾”病主要病因的方剂为主，有中毒症状时辅以藏医治疗毒症药物仁青芒觉[12]；早上以七味红花殊胜散（n=178）、十三味红花丸（n=80）、甘露月晶丸（n=78）等保肝和助胃火类方剂配合应用；因“青乃丹吾”在藏医学中属于热病的范畴，且中午又恰为热病之发病期，故在中午时选择十八味红花散（n= 179）、九味牛黄丸（n= 52）等清热除瘟的方剂进行治疗；晚上则选择松石胶囊（n= 141）、甘露月晶丸（n=60）等舒肝调隆的方剂，因为在藏医学中隆病是很多疾病的诱因，因此在疾病治疗过程中需时刻监视和调和隆，这样才能起到良好的治疗效果。

方剂分类分析结果显示，尼玛国医大师治疗“青乃丹吾”的104首方剂中，清热解毒药和温胃消食药的使用频率最高，其次为清肝热药、调和查隆药和驱虫药，再次为干黄水、调理白脉药和调隆安神药。此结果很好地揭示了国医大师尼玛针对“青乃丹吾”是精华未化导致精华随糟粕混合入脉，瘟毒蓄积于肝脏而引起的基本病机，陈旧热和瘟毒是“青乃丹吾”的本质，隆失调为其常见伴发病等特点，进行标本兼职的基本原则和用药规律。

图7 交集基因GO功能富集柱状图

频数≧12的方剂的味、化味和药性聚类分析结果显示，六味中以苦和甘为主，辛涩为次；三化味中以苦和甘化味为主，主治赤巴病及兼顾隆的调节；药性聚类中钝、凉、重、稀、糙为一类，药性数值最高，分别作用于赤巴的锐、热、轻和隆的轻、柔等性质，具有清热、止痛、解毒、安神、清脉管等功效。第二类药性聚类中柔、润、稳、轻、动、干、热、温、燥、锐、寒、软等药性数值相对较高，其中温、燥、锐的药性值最低，提示国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的药性配伍以递增钝、凉、重、稀、糙为主，递减稳、燥、锐的药性为辅，在消除疾病本质的同时，加强对隆的调和，以防止病情反弹。

图8 KEGG通路富集分析气泡图

通过BATMAN-TCM、Genecards、String 数据库对高频药物诃子、木香、红花进行网络药理学分析发现，与乙型肝炎有关的主要靶点有AKT1、TNF、JUN 等，GO 功能主要富集在核受体活动、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体活性、羧酸结合等生物过程。KEGG 通路主要富集在Rap1 信号通路、鞘脂信号通路、ErbB 信号通路、HIF-1信号通路、FoxO 信号通路等，表明高频药物的活性成分和关键靶点可能通过调控上述主要生物功能和通路达到治疗乙型肝炎的目的，但这一预测尚需通过相关药理和分子生物学实验进行验证。

综上，本研究通过采用数据挖掘技术初步分析了国医大师尼玛治疗“青乃丹吾”病的用药特点和规律，并利用网络药理学分析预测了潜在作用靶点。得出尼玛国医大师治疗“青乃丹吾”病以解毒、清肝热、保肝为主，辅以调和隆和养胃火，使用方剂的药性配伍以钝、凉、重、稀、糙为主。推测AKT1和TNF 可能是治疗乙型肝炎的潜在关键靶点。本研究是对尼玛国医大师多年治疗藏医“青乃丹吾”病经验的总结，可为后续深入研究藏医治疗“青乃丹吾”病的作用机制和指导藏医临床用药提供新的思路。