运用1H-NMR技术研究补肾强督法对强直性脊柱炎代谢组学的分析＊

梁伟东，彭剑虹

（东莞市中医院风湿科 东莞 523200）

强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是以青少年男性发病为主的自身免疫性疾病，以骶髂关节及脊柱疼痛、僵直为主要症状，逐渐出现脊柱畸形，最终可致残疾，使人失去生活自理能力，增加家庭及社会负担[1,2]。目前本病的治疗目标是改善病情、延缓病程进展、提高病人生活质量[3]。西医治疗分为传统治疗及生物制剂治疗。传统治疗包括消炎止痛药及免疫调节机，但疗效一般，且副作用较大；生物制剂初期有一定疗效，但由于费用昂贵，患者往往因为停药及由于药物本身的耐药性出现病情反复。本病属于中医的“大偻”的范畴，临床上往往伴随怕冷、四肢冰冷、梦中流涎等一派督脉虚寒之象。清代名医张锡纯认为治疗本病关键是补肾强督脉，并创造益督丸治疗本病。通过大量的前期临床验证表明，我们发现益督丸不仅能有效缓解病人腰背疼痛情况，还能扶正固本，缓解强直性脊柱炎其他伴随症状，提高生活质量，提示治疗本病疗效确切。但由于益督丸成分多而复杂，其作用靶点是多元性，多途径的，药理机制还待进一步挖掘。因此，课题组基于代谢组学，运用1H-NMR技术从成分-靶点-通路预测益督丸代谢网络，阐述中药治疗机制，实现中医药研究现代化。

1 受试者和试剂

1.1 一般资料

强直性脊柱炎患者25例均来自于东莞市中医院，（其中男14 例，占56%，女11 例，占44%，平均年龄31.64±4.23岁），本课题研究的整个过程中，所纳入的25例病例中脱落了1例。此1例不作统计学分析。

1.2 纳入标准

①临床诊断标准参考强直性脊柱炎1984年美国风湿病学会修订的纽约标准；②中医证候标准参照《国家中医药管理“十一五”重点专科协作组大楼（强直性脊柱炎）诊疗方案》中关于肾虚督寒的中医诊断标准。③年龄介于16-60岁。

1.3 排除标准

①妊娠或哺乳期妇女；②年龄不符合纳入标准；③合并糖尿病、冠心病、肾功能不全、肿瘤及精神病等基础疾病患者；④同时患有其他风湿免疫性关节炎，如白塞氏病、银屑关节炎患者；⑤拒绝中药治疗及对中药不耐受者。

1.4 剔除标准和脱落标准

治疗过程未按时进行复诊，自行停用中药治疗，或西医治疗方案转换其他治疗方案者；治疗过程出现严重不良事件或反应，导致病情加重，应该退出临床试验。

1.5 病例分组

强直性脊柱炎组（A 组），25 例，抽取血清本，并进行证候积分及疾病活动度评估。固定西医治疗方案，接受中药汤剂（益督丸）治疗3个月，再次抽取血清，并完善证候积分及疾病活动度评估，我们定义为B 组。治疗过程中由于1 例不能按时复诊服用中药，造成脱离。

1.6 益督丸组成

桑寄生15 g、续断10 g、菟丝子15 g、狗脊15 g、茯苓12 g、泽泻20 g、五味子6 g、砂仁10 g、杜仲15 g、怀牛膝12 g、鹿角霜15 g 等。水煎服，每日1 剂。药物来源：东莞市中医院。

1.7 试剂

无水磷酸二氢钠（NaH2PO4）来自广试有限公司，二水磷酸氢二钠（Na2HPO4）来自粤侨有限公司，重水（D2O）来自杭普实验器材有限公司。

1.8 实验仪器

超导核磁共振波谱仪（Varian NMR System 500 MHz，美国瓦里安有限公司）；全自动生化分析仪BS-220（迈瑞Mindray）；微孔板振荡器（无锡杰瑞安仪器设备有限公司）；核磁管（宁杭普实验器材有限公司）；TGL-20M 台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

2 实验和方法

2.1 样品预处理

抽取患者血样6 mL，于4℃，频率为10000 Hz下离心10 min，吸取上层血清300 μL 至核磁管中，再吸取0.2 mol·L-1磷酸平衡液（pH=7.4）200 μL和重水50 μL，振荡混匀。

2.2 NMR实验

在25℃条件下，设置脉冲序列为Carr-Purcell-Mei boom-Gill，谱宽为10000 Hz，回波时间为1 ms，进行64 k采样点数，64次循环次数，128次叠加次数核磁扫描。核磁信号经过傅立叶变换转为图谱。

2.3 图谱处理

使用专业软件MestReNova（version 8.0.1）进行图谱分析，把乳酸峰（δ1.33）作为化学位移参考峰，对所得图谱进行相位、基线调整，自动积分，其区域规定为δ0.5-9.0，以0.005 ppm 为积分间隔。消除δ4.7-5.1区域水峰（积分值设为0），将所得积分数据归一化处理，以Excel形式保存，进行下一步多元化统计。

2.4 数据处理

把上述积分数据导入SIMCA-P+14.0软件（Umetrics，瑞典）进行PCA（主成分分析），PLS-DA（偏最小二乘法判别分析），OPLS-DA（正交偏最小二乘法判别分析）统计分析。作为评估模型验证参数的R2和Q2，大于50%提示模型统计有效。OPLS-DA 结果使用得分图（Score plot）和载荷图（Loading plot）的形式表示。通过分析得分图中组间积分差异化学位移，在载荷图找出对这种差异贡献值，并结合一维NMR 谱图峰值变化，寻找相对应的代谢产物。其他实验数据使用软件SPSS21.0 进行统计。计量资料使用±s表示，进行t检验。计数资料以%表示，进行X2检验。

3 实验结果

3.1 两组治疗前后中医证候疗效比较

我们发现经过治疗后两组在腰痛、晨僵、夜间疼痛、怕冷乏力及四肢不温等指标具有较大改善，具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

3.2 两组治疗前后炎症因子比较

患者治疗后AS患者在枕墙距、指地距、强直性脊柱炎功能指数（BASFI）、强直性脊柱炎疾病活动性指数（BASDAI）均较大改善，具有统计意义（P＜0.05）（表2）。

3.3 两组治疗前后各测量值比较

患者治疗后AS 患者在白介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-a（TNF-a）明显减少，具有统计意义（P＜0.05）（表3）。

表1 两组治疗前后中医证候疗效比较

表2 两组治疗前后炎症因子比较

表3 两组治疗前后各测量值比较

3.4 患者治疗前后的1H-NMR测定分析

通过观察AS 患者治疗前1H-NMR 图（图1）谱差异，并运用Human Metabolome Database、Metlin 代谢组学数据库并参考相关文献[4-7]对图谱中存在差异的代谢产物进行峰值归属标记，我们发现有10种存在差异代谢产物。对于差异较少的产物且不能确定是否存在统计意义的，需要进行多元系统分析。

图1 AS组（红线）和治疗组（绿线）血清核磁图谱。

3.5 患者治疗前后的非监督PCA分析

我们对患者治疗前后进行非监督PCA 分析。我们观察到两组分布情况能够基本区分开，但仍有部分重叠（PC1 vs.PC2，R2=91.4%，Q2=80.8%）（图2）。为了得到更有明显的统计意义，方便寻找潜在中药作用靶点，我们对数据进行进一步的PLS-DA 和OPLS-DA分析。

3.6 患者治疗前后的1H-NMR 的PLS-DA 和OPLSDA分析

我们进一步进行PLS-DA 分析（R2x=81.3%，R2Y=81.2%，Q2(cum)=75.6%）（图3），从得分图发现两组分布差异基本上能达到完全分开，但两组个别样本分布相对分散。为了找到与中药作用靶点高度相关的代谢物，我们进行此基础上OPLS-DA 分析来，提高模式识别方法的判定能力（R2x = 87.5%，R2Y = 91.3%，Q2(cum) = 72.3%）（图4a），可以观察到两组的样本无交叉和重叠，能够在得分图中提示完全分开，且两组各自集中分布，表明其模式是有效。结合两组OPLS-DA结果的载荷图（图4b），用权重系数（VIP）＞1，发现78个差异变量，其中筛选出13 个代谢物，并对治疗前后的浓度变化情况的进行对比，确定代谢物变化趋势。可以得到代谢物如下：羟丁酸盐、前列腺素D2、丙氨酸、精氨酸、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸盐、α-酮戊二酸、甜菜碱、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸及瓜氨酸。

图2 AS组与治疗组PCA分析

图3 AS组（●）和治疗组（●）PLS-DA分析图

图4 a AS组（●）和治疗组（●）OPLS-DA得分图

我们进一步采用建立coefficient-loading 相关图的形式，运用back-scaling 的数据处理模式，得到的图谱为NMR 图谱的形状[8]，从而可以清楚显示两组代谢物的变化趋势。由于我们把治疗前AS 组定义为原始观察对象，相关图中峰值向上代表在经治疗后代谢物的含量上升，而峰值向下则说明经治疗后患者代谢物的含量下降。从相关图的颜色分布我们得知，颜色越红表示贡献率越大，表示本代谢无在两组之间的差异越显著；颜色越蓝表示贡献率越小，相应的代谢物在两组之间的差异不显著。由于本研究中的统计计量数为49，根据相关系界值数表查得其相关系数临界值|r|为0.456，如果代谢物的相关系数绝对值超过0.456，说明该代谢物具有统计意义。我们发现羟丁酸盐、前列腺素D2、丙氨酸、精氨酸、甜菜碱、脯氨酸、谷氨酰胺及酪氨酸水平上升，而谷氨酸盐、α-酮戊二酸、甘氨酸、马尿酸盐、葡萄糖、胆碱及瓜氨酸水平下降（图5、表4）。

图4 b AS组（●）和治疗组（●）OPLS-DA散点图

图5 AS患者治疗前后代谢产物差异对比图

表4 两组代谢产物的名称及变化

3.7 潜在代谢通路分析

代谢物的变化可以反映整体代谢信息网络，寻找异常代谢通路。把上述异常代谢物输入MetaboAnalyst 4.0 进行分析，发现9 条重要的代谢通路，分别为酪氨酸通路，谷氨酰胺-谷氨酸通路，精氨酸通路，谷氨酸代谢通路，苏氨酸-甘氨酸通路，精氨酸和脯氨酸通路，淀粉与葡萄糖通路，前列腺素D2 通路，马尿酸盐通路其中前7 条Pathway Impact ＞0.1，被列为最主要的代谢途径（图6）。根据实验结果，结合KEGG 数据库，涉及到的代谢通路包括糖代谢、能量代谢、脂质代谢及氨基酸代谢，同时可能涉及人体神经-内分泌系统、免疫系统及肠道微生态调节（图7）。

4 讨论

《内经》曰“督脉为病，脊强反折。腰痛不可以转摇，急引阴卵，刺八与痛上，八在腰尻分间。”“膀胱足太阳之脉，挟脊抵腰，是动则病脊痛，腰似折。”《景岳全书》曰“腰为肾之府，肾与膀胱为表里，故在经则属太阳，在脏则属肾气，而又为冲任督带之要会。所以凡病腰痛者，多由真阴之不足，最宜以培补肾气为主。”可见腰痛与督脉、膀胱经功能失调有关。而督脉总督一身之阳经，循行人体背部，六条阳经都与督脉交会于大椎，督脉有调节阳经气血的作用。督脉虚寒，肾虚亏虚是强直性脊柱炎发病得关键。清代名医张锡纯认为补肾强督脉是治疗本病的基础大法，发明益督丸，用于本病治疗，收到了良好临床效果。从研究结果得知（表1、表2），不改变患者原有西医治疗方案的基础上，联合使用益督丸治疗，可以有效缓解患者腰痛及晨僵等症状，提高患者脊柱活动度（枕墙距、指地距等），对于一些西医难以缓解的症状，如怕冷乏力、四肢不温及失眠等，均有明显的改善，提示益督丸对本病的疗效确切。我们进一步研究发现益督丸能够改变人体代谢网络系统，现从如下7 条代谢途径展开讨论。

图6 AS患者治疗前后代谢网络分析图

图7 AS患者治疗前后代谢通路分析图

4.1 葡萄糖代谢、能量代谢异常与AS的关系

丙氨酸属于非必需氨基酸，主要代谢通络为参与丙氨酸-葡萄糖循环，在生理条件下，丙氨酸在肝脏脱去氨基变成丙酮酸，后者参与糖异生过程生成葡萄糖，在肌肉有氧代谢中提供葡萄糖。丙氨酸的水平越低，提示外周肌肉组织对葡萄糖利用增加。本次研究发现，AS患者经治疗后丙氨酸，葡萄糖水平下降，说明益督丸可改善患者外周肌肉组织对葡萄糖利用。

我们对葡萄糖代谢进行进一步跟踪，发现其参与的三羧循环的α-酮戊二酸、谷氨酸和羟丁酸盐水平异常。有氧条件下，葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸，进入三羧循环，后者经异构并氧化脱羧生成α-酮戊二酸，在有氧代谢不充分情况下，α-酮戊二酸可以在体内与氨作用，生成谷氨酸。羟丁酸是酮体的主要组成成分，占酮体总量的70%，提示存在糖及脂类代谢障碍，氧化分解后成为羟丁酸盐和水。经治疗后α-酮戊二酸、谷氨酸水平下降，羟丁酸盐水平上升，提示中药治疗可以有效改善患者三羧循环，促进有氧代谢，为人体提高能量，改善怕冷、四肢不温及疲倦乏力等状态。因此我们认为益督丸具有改善患者能量代谢网络通路的能力。

4.2 甘氨酸代谢通络与AS的关系

胆碱是一种强有机碱，是卵磷脂的组成成分，与脂肪酸以磷脂形结合，在苏氨酸作用下，促进脂肪酸氧化分解，并在肝脏和肾脏中提供甲基与甜菜碱，合成甘氨酸。陈丽虹等[9]研究表明，甘氨酸具有调节炎症反应作用，具有抑制炎症细胞因子的转录，使炎症因子及氧自由基合成下降。我们研究发现经治疗后患者甜菜碱、胆碱水平上升，甘氨酸水平下降，提示甘氨酸代谢通路得到改善，同时我们发现经治疗后患者IL-6、TNF-a 等炎症因子下降，TNF-a 是最重要的炎症因子，引发人体的炎症风暴，通过诱导如IL-6 等多种炎症因子上调表达，作用血管内皮细胞及炎症细胞，几何级放大炎症反应和毒性作用，造成组织细胞损害[10-12]，我们研究发现经治疗后患者上述炎症指标下降，提示益督丸具有降低炎症反应，可能与甘氨酸代谢通络有关。

4.3 氨基酸代谢异常与AS的关系

人体中含有多种神经-内分泌调节活性物质，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等，酪氨酸是这些物质合成的基础[13]。中医认为肾为先天之本，先天元气所藏之处，而脊柱乃一身之骨主，督脉循脊入骶、贯脊属肾，督脉为肾所主。肾主温煦、藏精功能与“神经-内分泌-免疫”网络有内在联系。益督丸具有温补命门强督之效，可以有效改善怕冷、四末不温及睡眠障碍，且本研究提示经治疗后患者酪氨酸水平上升，提示其作用靶点可能与对神经-内分泌有调节有关，需要后期研究进一步证实。

AS 与人体白细胞抗原HLA-B27 编码基因高度相关。HLA-B27 基因属于Ⅰ型MHC 基因，广泛分布于各组织有核细胞表面的肽结合性异二聚体，有1 条重链和2 个b2 微球蛋白，并与含精氨酸的9 肽相结合，CD8+细胞毒T 细胞识别其肽链，启动免疫反应[14]。提示精氨酸可能参与HLA-B27 表达，增强细胞免疫反应。另有研究表明，精氨酸代谢，与细胞凋亡相关，可能会导致哮喘患者线粒体呼吸链损伤，临床上表现乏力倦怠、气促等阳气虚证表现[15]，与本研究结果一致。我们发现经治疗后，患者精氨酸水平上升，提示益督丸可能改善患者免疫代谢及改善患者“阳气虚”状态。

前列腺素D2 是最强效的内源性睡眠促进物质，可诱导生理性睡眠[16]。前列腺素D2 具有潜在的镇静催眠作用，未来可能成为睡眠得良好调节剂。临床上发现AS 患者常因熬夜、失眠等因素导致病情加重。改善睡眠质量，对强直性脊柱炎有较大的帮助。同时前列腺素D2 具有减少炎症因子对分泌而起到抗炎、镇痛、解热的作用，对强直性脊柱炎腰痛具有明显缓解作用[17]。我们发现，经治疗后患者前列腺素D2水平上升，提示益督丸可能潜在有调整睡眠、消炎止痛作用。

脯氨酸促进牙釉质修复，使得牙齿更加坚固并富有弹。脯氨酸是生产羟脯氨酸和羟赖氨酸所需要的，胶原有助于愈合软骨，并给关节和脊椎提供缓冲。中医认为，肾主骨，藏精而生髓。病理情况下，督虚元气失藏，不能生髓，“髓”功能异常，临床表现为腰痛，晨僵，脊柱活动指数下降。本研究发现AS 患者经治疗后水平上升，提示益督丸改善脯氨酸代谢通路，可能具有改善胶原蛋白、软骨合成，起到缓解骶髂关节炎症。

4.4 肠道功能紊乱与AS的关系

谷氨酸被谷氨酰胺合成酶转化为谷氨酰胺，谷氨酰胺再被转运回合成谷氨酸，参与谷氨酸-谷氨酰胺循环。在肠绒毛上部成熟线粒体，谷氨酰胺经脱氨基，生产瓜氨酸和一氧化氮，后者可刺激tj 蛋白的表达，此过程提供能量[18]，谷氨酰胺可促进肠道细胞ATP生成，是肠内能量生成的最大贡献者，并改善脓毒症患者肠粘膜屏障功能[19]。患者研究发现经治疗后AS患者谷氨酸、瓜氨酸水平下降，谷氨酰胺水平上升，提示谷氨酸-谷氨酰胺循环得到改善，促进肠道细胞能量代谢。马尿酸盐为肠道微生物将饮食中的芳香族化合物代谢形成，经治疗后马尿酸水平下降，提示加速肠道菌群代谢。益督丸组方中，非一味重视温阳，我们同时重视后天脾胃功能，方中重要茯苓、泽泻健脾利湿，砂仁交会中宫，改善患者脾胃功能，而中医的脾胃功能可能与肠道微生态息息相关。本研究发现，经治疗后患者谷氨酸-谷氨酰胺代谢通路及马尿酸盐代谢通路得到改善，我们推测可能潜在具有改善肠道菌群的作用。

综上所述，本研究使用1H-NMR 技术的代谢组学方法，分析使用益督丸治疗AS 患者共筛选出13 个代谢产物、9个代谢途径，涉及糖代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢、三羧酸循环等多条途径，且经治疗后患者证候评分及炎症指标均得到改善，提示益督丸对强直性脊柱炎的治疗靶点是具有多环节、多层次、多靶点的特点，代谢组学对方剂的研究具有一定的意义，是中医药现代化探索的重要途经，同时我们也具有一定局限性，仍需要后期完善免疫水平及组织病理检查，来验证本研究结论。