AQP2、HSP70在痛风湿热蕴结证模型中表达的意义＊

郭玉星，朱珊莹，康佩芝，汤 智，易法银＊＊，邵先舫，熊 辉，刘永利，毛 果

（1. 湖南中医药大学 长沙 410208；2. 湖南省中医药研究院附属医院 长沙 410006；3. 常德市第一中医医院 常德 415100；4. 湘潭市中医院 湘潭 411100）

痛风作为一种临床常见的代谢性疾病。随着人们饮食结构的变化，患者数量猛增，有赶超糖尿病成为第一大代谢性疾病之势，因其病程长及难以治愈性的特点，严重影响着人类生命健康和生存质量。目前临床治疗痛风药物主要以秋水仙碱、非甾体消炎药、糖皮质激素等缓解急性症状，苯溴马隆、别嘌呤醇等降尿酸治疗，虽然上述化学药物治疗效果可，但它们不良反应（如肝肾损害、胃肠道反应等）限制了它们的使用，尤其是痛风易反复发作且需长期服药的特点，因此探寻一种安全性高、副作用小的治疗药物迫在眉睫。中医药对痛风认识已久，几千年来痛风被称为“历节”“痹症”等范畴。诸多资料记载中医药对其治疗效果良好，因此从浩瀚的祖国医学中探寻防治痛风药物并对其作用机制、作用靶点研究具有重要意义。近年研究表明，痛风中湿热蕴结是主要证型，课题组在临床中也反复证实并以清热利湿立法治疗该病取得了非常好的临床疗效；实验方面也研究过清热利湿立法的中药复方治疗痛风性关节炎的作用机制，但是实验造模常采用经典的大鼠模型（即关节腔注射尿酸钠复制急性痛风性关节炎），不能区分痛风各类证型及辩证论治，加之国内学者有关痛风及湿热证的探讨虽多，但涉及痛风与中医湿热蕴结证病机及病证结合模型的研究较少[1]，因此探讨中医药复方干预痛风湿热蕴结证效应的研究具有重要意义及一定的创新性，通过诸多文献学研究发现水通道蛋白-2（AQP2）、热休克蛋白70（HSP70）与湿热关系密切。因此课题组通过建立痛风湿热蕴结证动物模型，并阐明该病症与AQP2、HSP70 表达关系的机理，这对进一步研究中医药复方治疗痛风湿热蕴结证作用机制及疗效判断具有重要的意义。本研究采用多因素复合造模方法复制湿热模型，在此基础上采用改良Coderre法[2]，复制痛风湿热蕴结证动物模型[3]，探讨基于AQP2、HSP70 表达相关的痛风湿热蕴结证可能的分子机制，为痛风“湿热蕴结”病机提供科学内涵。现报告如下。

1 材料

1.1 实验动物

本实验选取8 周龄的SPF级健康成年SD 雄性大鼠作为实验对象，它们体质量为（200±20）g，4 组共40只，每组10只。实验动物由湖南中医药大学动物实验中心提供。

1.2 主要实验试剂

造模试剂：52%红星二锅头酒为北京红星股份有限公司生产，尿酸钠盐购于北京索莱宝科技有限公司Solarbio产品等；

检测试剂：AQP2 试剂盒购于碧云天生物技术研究所，HSP70 检测试剂盒购于上海超研生物科技有限公司，尿酸（UA）检测试剂盒购于德国罗氏诊断有限公司等。

1.3 主要仪器设备

人工气候箱（型号：QHX-300BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司），双目生物显微镜及图像采集和分析软件（型号：MoticB1，麦克奥迪实业集团有限公司），北京普朗酶标仪（型号：DNM-9602，北京普朗新技术有限公司），台式高速冷冻离心机（型号：TGL20，长沙英泰仪器有限公司），微型漩涡混合仪（型号：WH-2，江苏盛蓝仪器制造有限公司）等。

2 方法

2.1 试剂制备

参照改良Coderre造模法，课题组前期造模中药物配制[2]。

具体步骤为：先称取微晶尿酸钠（monosodium urate，MSU）1250 mg，然后加生理盐水（normal saline，NS）45 mL,再加吐温80（Tween-80）5 mL，将它们加热并充分搅拌，以上共同制备成浓度为25 g·L-1的尿酸钠溶液，备用。

2.2 动物分组与造模

痛风湿热证造模方法参照课题组尹明等[3]造模方法。

2.2.1 分组

40 只SPF级健康成年SD 雄性大鼠，适应性喂养1周后，采用随机数字表方法分为正常对照组、痛风模型组、湿热模型组、痛风湿热模型组，每组10只。

2.2.2 造模

（1）正常对照组

在正常温湿度环境（24-28℃、相对湿度60%-75%），给予普通饲料、自由饮水喂养，造模共计15日。

（2）痛风模型组

前15日同正常对照组。在第15日用5 号注射器针头于受试大鼠右侧踝关节外侧后方进行穿刺（注意针口斜面朝前上方，针尖与胫骨成45°），刺入右踝关节腔后，予以提前配置好的25 g·L-1浓度的尿酸钠溶液50μL 注入踝关节腔（以关节囊对侧鼓起为标准），制备（急性）痛风模型。

（3）湿热模型组[3]

前10日，在正常温湿度环境（见正常对照组），大鼠喂食普通饲料+200 g·L-1蜂蜜水自由饮用（作为高糖），并采用油脂和白酒隔日交替方式（油脂0.1 g·kg-1（作为高脂）、52°白酒（红星二锅头）0.1 mL·kg-1）。第11 天到15 天，将大鼠放入人工气候箱中，温度调节为(32±2）℃，相对湿度(92±3)%。湿热度造模时间为每日上午8-12 点，下午1-5 点，上述方法共持续5日，以制备湿热证模型。

（4）痛风湿热模型组

综合痛风模型组、湿热模型组两组造模方法，前15日喂养造模同湿热模型组，第15日起踝关节造模同痛风模型组，制备痛风湿热证模型。

2.3 一般情况观察

考虑到湿热证临床特点及动物症状辨别的可行性，实验组主要选取8个时相点进行一般情况的观察，观察的内容包括受试大鼠的外观、精神状态、食饮量、体质量等的变化情况。

8 个时相点分别为：造模开始（即第1日），造模过程中（第5日），开始进入人工气候箱（第11日），痛风造模开始（第15日），及痛风造模结束后3 h、6 h、12 h、24 h。

2.4 关节炎症指数[4-6]

2.4.1 分级标准

0级：正常，计0分；

1级：踝关节处皮肤发红，轻度肿胀，可见其关节周围骨性标志，计2分；

2级：踝关节处出现明显发红，局部明显肿胀，但肿胀仅局限在踝关节部位，其关节周围的骨性标志消失不可见，计4分；

3级：包含2级情况，同时出现踝关节部位以外肢体肿胀，计6分。

2.5 造模72 h各组大鼠的步态情况

参照大鼠步态分级评分标准[4-6]:

0级：正常行走，计0分；

1级：轻度跛行，其右下肢出现稍微弯曲状态，计2分；

2级：明显跛行，其右下肢在行走过程中仅能刚刚触及地面，计4分；

3级：重度跛行，其右下肢在行走过程中不能触及地面，仅可余三足行走，计6分。

2.6 尿液AQP2含量测定

造模开始后第15日，将各组实验受试大鼠分别放于单独的代谢笼中，遵循禁食但可任意饮水的要求。收集每只大鼠24 h 的尿液，对其进行低温离心并取上清液，使尿液浓缩，量达至＜1 mL，置于-20℃冰箱中冻存。课题组采用的考马斯亮蓝法（Bradford）来测定尿液中的AQP2 含量。采用的方法为：以标准品浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，在坐标轴上绘制标准曲线，并得出标准曲线的直线回归方程，从而计算样品浓度，其代表尿液AQP2含量。

2.7 血浆HSP70、血尿酸含量测定

造模开始后第16日，先集中用一定浓度的水合氯醛腹腔注射使各大鼠麻醉，然后采用腹主动脉取血方法进行取血，取血约为2 mL，将其注入到含30 μL 7.5%EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠盐）和40μL 抑肽酶的试管中，充分混匀，再在4℃下离心10 min（采用3000 r·min-1转速，其离心半径为30 mm），分离血浆。将样品置于-20℃冻存。需要检测时，取出并采用酶联免疫吸附法（ELISA）对其血浆中HSP70、血尿酸的含量进行检测。

2.8 踝关节滑膜组织病理检测

各组实验大鼠处死后，以其右踝为中心，分别从其上下0.5 cm 处进行离断，取右踝关节及周围软组织，再迅速切取踝关节滑膜（在显微镜下用尖刀片剥取），将剥取的滑膜置于40 g·L-1中性甲醛溶液中固定。然后采用100 g·L-1的乙二胺四乙酸进行脱钙，再经过常规脱水、透明、包埋、切片、HE 染色（苏木精-伊红染色）程序，将玻片置于电镜下，观察各组大鼠右踝关节滑膜组织病理变化，并进行比较。

2.9 统计学方法

所得数据，课题组采用SPSS 17.0统计软件进行分析。针对4 组尿液AQP2、血浆HSP70 含量：采取方差分析进行组间总体比较，采用LSD-t检验进行组间两两比较，以α=0.05为标准。

3 结果

3.1 一般情况观察结果

大鼠喂养期间，正常对照组一般情况（外观、精神状态、食饮量、体质量等）均正常；痛风模型组大鼠在造模前一般情况均正常，自第15日造模后出现食饮减少，烦躁不安，右踝关节明显红肿，关节局部皮温升高，并伴活动受限情况；湿热模型组大鼠在开始造模后渐渐出现毛发蓬松、色枯槁，倦怠懒动、行动呆滞，食饮减少，小便黄，接着出现大便溏泻或粘腻的表现；痛风湿热模型组大鼠造模后前15日一般情况与湿热模型组大鼠相似，自第15日开始，合并出现痛风模型组大鼠造模后的表现。说明通过湿热及急性痛风造模后，实验大鼠出现了痛风、湿热证的一般表现。

3.2 各组大鼠踝关节炎症指数及步态评分比较

与正常对照组比较，痛风模型组、痛风湿热模型组踝关节炎症指数明显增高，具有统计学意义（P＜0.05）；与湿热模型组对比，痛风模型组、痛风湿热模型组踝关节炎症指数明显增高，具有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组与湿热模型组比较，痛风模型组与痛风湿热模型比较，踝关节炎症指数均无统计学意义（P＞0.05，P＞0.05）。与正常对照组比较，痛风模型组、痛风湿热模型组步态评分明显增高，具有统计学意义（P＜0.05）；与湿热模型组对比，痛风模型组、痛风湿热模型组踝关节步态评分明显增高，具有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组与湿热模型组比较，痛风模型组与痛风湿热模型比较，步态评分均无统计学意义（P＞0.05，P＞0.05）。以上提示经过改良Coderre 法造模后大鼠踝关节炎症指数及步态评分均明显增加，符合急性痛风性关节炎表现（表1）。

表1 痛风造模72 h后各组大鼠踝关节炎症指数、步态评分比较（n = 10,±s）

表1 痛风造模72 h后各组大鼠踝关节炎症指数、步态评分比较（n = 10,±s）

注：与正常对照组比较，★P ＜0.05；与湿热模型组比较，▲P ＜0.05

组别正常对照组痛风模型组湿热模型组痛风湿热模型组踝关节炎症指数0±04.21±0.42★▲0±04.07±0.67★▲步态评分0±04.04±0.82★▲0±03.95±0.71★▲

3.3 踝关节滑膜组织观察结果

正常对照组及湿热模型组大鼠右踝关节及其周围组织结构清晰完整，滑膜正常，无明显组织病理学改变表现；痛风模型组大鼠右踝关节及其周围组织可见滑膜壁增厚，炎症细胞浸润，痛风湿热模型组表现同痛风模型组，亦可见明显的炎性细胞浸润。在给痛风模型组、痛风湿热模型组大鼠手术取标本时，各大鼠右踝关节腔内均可见明显的尿酸盐结晶沉积。提示经过改良Coderre造模法造模后，受试踝关节出现尿酸钠沉积及表现出明显的炎症病理变化（图1）。

图1 受试踝关节滑膜组织病理表现（×200）

3.4 各组大鼠尿液AQP2、血浆HSP70、血尿酸含量变化比较

4组大鼠尿液AQP2含量比较：正常对照组与痛风模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；湿热模型组和痛风湿热模型组比较，无显著性差异（P＞0.05）。正常对照组明显低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）；痛风模型组明显低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）。提示通过复合型湿热造模后尿液AQP2明显增高（表2）。

表2 4组大鼠尿液AQP2、血浆HSP70、血尿酸含量比较（n = 10,±s）

表2 4组大鼠尿液AQP2、血浆HSP70、血尿酸含量比较（n = 10,±s）

注：与正常对照组比较，★P ＜0.05；与痛风模型组比较，◆P ＜0.05

组别正常对照组痛风模型组湿热模型组痛风湿热模型组AQP2/(mg·mL-1)0.237±0.0110.229±0.0160.254±0.013★◆0.247±0.022★◆HSP70/(pg·mL-1)19.39±2.7719.96±2.5746.08±4.52★◆45.93±4.64★◆血尿酸/(μmol/L)199.12±45.70207.88±37.08246.58±69.11★▲264.75±44.85★▲

4 组大鼠血浆HSP70 含量比较：正常对照组与痛风模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；湿热模型组和痛风湿热模型组比较，无显著性差异（P＞0.05）。正常对照组明显低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）；痛风模型组明显低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）。提示通过复合型湿热造模后血浆HSP70明显增高（表2）。

4 组大鼠血尿酸水平比较：正常对照组与痛风模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；湿热模型组和痛风湿热模型组比较，无显著性差异（P＞0.05）。正常对照组低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）；痛风模型组低于湿热模型组和痛风湿热模型组（P＜0.05；P＜0.05）。提示提示通过复合型湿热造模后血尿酸也有一定增高（表2）。

4 讨论

随着社会快速发展，人类饮食结构变化，号称“富贵病”的痛风患者越来越多，其中湿热蕴结型是其常见证候类型[7-9]。在临床中，湿热蕴结证为主要证型[10，11]，因此通过建立痛风性关节炎湿热证动物模型，对其相关分子机制进行研究，具有重要的临床和科研意义。

根据《中医内科病证诊断疗效标准》[12]中关于痛风湿热蕴结证的诊断标准：下肢小关节突发红肿热痛，其局部拒按，触之有灼热感，遇热则重，得凉则缓；并伴发热口渴，小便色黄，舌质红，苔黄腻，脉象滑数。在本实验结果中从大鼠的一般状态提示：痛风湿热证模型组中大鼠的一般状态表现与上述痛风湿热蕴结证的诊断标准中表现相符合。本实验结果提示大鼠踝关节炎症指数、步态评分可以能够作为证明痛风造模成功的重要指标，从而揭示可以作为证明痛风加湿热模型造模成功的一个重要因素。在对受试右踝关节进行局部解剖取材时发现痛风模型组及痛风湿热证模型组大鼠关节中明显可见尿酸钠结晶的沉积，这两组滑膜的病理形态变化均符合尿酸钠结晶诱导大鼠急性痛风性关节炎模型的滑膜组织病理变化[13]，也进一步证实痛风造模成功，保障了实验的正行性及后续研究可信性。

水通道蛋白（AQPS），又称为水孔蛋白，是一种特异性的转运水的蛋白，它可显著增加细胞膜对水的通透性，常在细胞内外平衡、对水的分泌吸收的调节中起重要作用。AQPS 目前已知有十三种亚型，而AQP2是其中常见的一种，它是存在于肾脏集合管中，具有调节水重吸收作用的关键蛋白之一[14]。付伟等实验研究发现[15]：尿液AQP2 含量变化可作为评价“湿”邪的重要指标。热休克蛋白(HSPs)是一种广泛存在的热应激蛋白，它的特点是当机体遭受热或其他应激刺激时，其表达则明显增多。目前共分为HSP70、HSP60等5类。而HSP70是其中最受关注且研究最为透彻的一种，它在应激刺激下合成最为迅速、表达丰度最高，被称为主要热休克蛋白。诸多实验证实AQP2、HSP70关系密切[16]。实验证实[17]检测AQP2、HSP70 可作为湿热证辨证论治的量化指标，因此将其用于对湿热观察具有一定的参考意义。

本研究中湿热模型组、痛风湿热证模型组尿液AQP2、血浆HSP70 含量低于正常对照组、痛风模型组，且比较差异有统计学意义；而湿热模型组与痛风湿热证模型组比较及正常对照组与痛风模型组比较，以上两指标均无统计学意义，从上述实验结果可以看出，AQP2 含量、HSP70 含量两个指标在判断湿热蕴结证型时有着重要作用。血尿酸水平是痛风病程度的一个重要指标，在本实验结果中提示:湿热模型的造模在一定程度上提高了模型大鼠血尿酸水平，而常规痛风造模（尿酸钠关节腔注射）并没有明显影响其血尿酸水平，说明湿热因素在痛风中具有重要作用。

综上所述，本研究结果提示：通过多因素（饮食+气候环境+致病因子+局部用药+全身用药）复合造模方法可以复制出痛风湿热蕴结证病证结合模型[3,18]，而且在判断痛风湿热蕴结证型时AQP2、HSP70 两个指标起着重要作用，痛风湿热蕴结证模型建立成功与否可选取观察AQP2、HSP70 含量变化以作为评价指标，其在临床治疗痛风湿热蕴结证患者疗效判定也可以作为重要参考指标，值得进一步研究。