肾阳虚型慢性再障患者CD3+CD19-和CD3+CD25+T细胞与血小板的多重线性回归分析＊

丁宇斌，唐旭东

（1. 中国中医科学院研究生院 北京 100700；2. 中国中医科学院西苑医院血液科 北京 100091）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种骨髓造血功能衰竭（bone marrow failure，BMF）综合征，主要表现为骨髓造血功能低下，全血细胞减少和贫血、出血、感染。目前认为AA 的骨髓衰竭是自身反应性细胞毒性T 淋巴细胞介导的造血干/祖细胞（HSPC）免疫破坏的结果。以强力免疫抑制剂抗胸腺细胞球蛋白（ATG）或抗淋巴细胞球蛋白（ALG）联合环孢素（CsA）为主的一线治疗方案可获得60-80%的有效率[1，2]，为此提供了有力的证据支持。慢性再生障碍性贫血（chronic aplastic anemia，CAA）较SAA病情相对稳定，但CAA 患者血象恢复过程中与中性粒细胞（ANC）、血红蛋白（HGB）相比，PLT的上升最为缓慢甚至可能终身未能恢复正常[3]，CAA 患者可因PLT 数量持续低下出现皮肤散在瘀点瘀斑，尿血便血，口腔粘膜、牙龈、舌面出血，或见视网膜火焰状出血及棉绒状渗出以及扇形较大面积视网膜前出血，严重影响患者生存质量，口腔内出血或眼底出血频发常提示颅内出血风险增加，严重威胁患者生命，因此探索和分析CAA 患者PLT 数量的影响因素具有重要的临床意义；且由于PLT 数量与CAA 患者的出血症状、出血风险和生存质量密切相关，通过预测PLT 数量在临床治疗后的转归有助于临床医师及时判断和评估CAA 患者在临床结局中的出血风险及其对患者生存质量的影响，有利于提高CAA 患者在临床治疗中的依从性和坚定患者的治疗信心。

中医根据AA 的临床表现特点，将AA 的中医学病名称为“髓劳病”，“髓”为病位，“劳”代表病情与病性。中国中医科学院西苑医院血液科自20 世纪90年代提倡补肾生血法联合ATG/ALG治疗CAA，已经取得了良好的疗效，总有效率高达80%[4-8]。肾阳虚型是CAA 患者最为常见的中医证型，此证型CAA 患者经中西医结合治疗的总有效率最高[9，10]，本研究拟选取肾阳虚型CAA 患者，在充分发挥中医药辨证治疗优势的同时，又能够使研究成果最大可能地适用于CAA 患者群体。本研究收集2018年09月13日到2018月10月18日就诊于西苑医院血液科门诊和住院部的肾阳虚型CAA患者外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞比例、CD3+CD25+T 细胞比例和PLT 共3 个参数，建立多重线性回归模型分析其线性关系并探讨肾阳虚型CAA 患者PLT数量在治疗转归中的预测因素。

1 研究对象

病例来源于2018年9月13日至2018年10月18日就诊于中国中医科学院西苑医院血液科门诊和住院部的肾阳虚型CAA患者共22例，其中男10例，女12例，年龄16-68岁，中位年龄43岁。

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准[11]

①血象：全血细胞减少，网织红细胞减少，淋巴细胞比例增高。②骨髓穿刺：多部位（不同部位）骨髓增生减低或重度减低；小粒空虚，非造血细胞比例增高；巨核细胞明显减少或缺如；红系粒系均明显减少。③骨髓活检：全切片增生减低，造血组织减少，脂肪组织和/或非造血细胞增多，网硬蛋白不增加，无异常细胞。④除外PNH、hypo-MDS/AML等其他疾病。

1.1.2 中医证候诊断标准[12]

肾阳虚证：乏力，心悸，气短，活动后加重，面白唇淡，甲床苍白，兼见畏寒喜暖，手足冷凉，腰酸，夜尿多，性欲减退，多无出血，或见大便稀溏，面浮肢肿，苔白质淡，脉细无力。

1.2 纳入标准

①符合西医诊断标准和中医证候诊断标准；②年龄16-80 岁；③肝肾功能正常；④未参加其他临床研究。

1.3 排除标准

①引起全血细胞减少的其他疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症、骨髓增生异常综合征、急性造血功能停滞、骨髓纤维化；②先天性再生障碍性贫血；③合并严重心、脑、肝、肾疾病及精神病患者；④妊娠、哺乳期妇女。

2 研究方法

2.1 签署知情同意书

告知检查目的，保护隐私，患者表示知情同意并签署知情同意书。

2.2 病例观察指标

外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞比例、CD3+CD25+T细胞比例和PLT。T淋巴细胞免疫分型检测方法：以肝素抗凝管（绿帽管）抽取空腹状态患者静脉血2 ml，以2-8℃冷藏运输标本至天津协和华美医学诊断技术有限公司进行检测，标本制备采用全血溶红细胞法，溶血素为BC OptiLyse C No-Wash Lysing Solution，抗体标记采用九色法，细胞获取数量10000个，抗体生产厂家BD，检测仪器BC NAVIOS，结果分析采用CD45/SSC 设门法。HGB 的检测方法：以EDTA抗凝管（紫帽管）抽取空腹状态患者静脉血2 mL，摇匀后用COULTER®LH 750 全自动血细胞分析仪进行检测分析（美国贝克曼库尔特公司），最终显示血常规分类的结果，其中包括PLT。

2.3 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行分析，将外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞比例、CD3+CD25+T 细胞比例和PLT进行多重线性回归分析。

3 结果

本研究采用多重线性回归，纳入外周血总T 细胞（CD3+CD19-）、活化T 细胞（CD3+CD25+）2 个自变量预测PLT。因学生化删除残差（SDR_1）有超过3 倍标准差的离群值1个，强杠杆点（LEV_1）＞0.5者1个，对这2条观测值予以删除。

已经验证研究观测值之间相互独立（Durbin-Watson 检验值为1.703）（表1）。本研究中两个自变量相关系数为0.093 ＜0.7（表2），且所有容忍度值都大于0.1，且方差膨胀因子皆小于2，表明自变量不存在多重共线性（表3）。各观测值Cook 距离皆小于1，即不存在强影响点，据此我们认为没有需要处理的异常值。根据标准化残差绘制的带正态曲线的柱状图和P-P图，判断回归残差近似正态分布（图1、图2）。

表1 预测模型汇总

表2 多重共线性分析

图1

图2

表3 多重线性回归结果

回归模型具有统计学意义（表4）F（2,17）=19.479（P＜0.001），R2= 0.696，调整R2= 0.660。纳入模型的2 个自变量对PLT 的影响均有统计学意义（P＜0.05），具体结果见表2。将表3 中系数代入回归方程，得：PLT = 391.585 - 5.104 × (CD3+CD19-) + 23.851 ×(CD3+CD25+)。

表4 ANOVAa

由模型结果知，CD3+CD19-T 细胞占淋巴细胞的比 例 每 增 加1%，PLT 平 均 降 低5.104 × 109·L-1，CD3+CD25+T 细胞占淋巴细胞的比例每增加1%，PLT平均升高23.851×109·L-1。

4 讨论

目前认为AA 的骨髓衰竭是自身反应性细胞毒性T 淋巴细胞介导的造血干/祖细胞（HSPC）免疫破坏的结果。AA 大致可以分为以异常免疫为主和以骨髓衰竭为主两个阶段，其中急性或重型AA（SAA）以异常免疫为主，此阶段AA 中医辨证多属肾阴虚型；CAA 以骨髓衰竭为主，此阶段患者辨证多属肾阳虚型[13]。既往研究[14-16]认为细胞毒T 淋巴细胞(CTL) 的异常活化和增殖是引起AA 造血功能衰竭的重要原因，所分泌的造血抑制因子如IFN-γ、TNF-α最终可导致造血功能衰竭，可能是AA的免疫病理学机制基础。T细胞亚群的表达、多种细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-10 和TGF-β）的水平皆与中医辨证分型密切相关，在肾阴虚型、肾阳虚型和肾阴阳两虚型AA 患者中呈现不同表现[14,17]。

近年研究[18-20]发现活化标记物CD25 不仅表达在活化的T细胞上，也表达于Treg细胞；Treg细胞表面标记物为CD4+CD25highCD127-/low，能够在大于90% 的CD4+CD25highCD127-/lowTreg 细胞中检测到细胞核蛋白Foxp3 的表达，且因Foxp3 能够抑制CD127 的启动子，CD127 与Foxp3 表达呈负相关，Foxp3highTreg 细胞呈现CD127low。Treg 细胞能够进行免疫负向调控从而维持机体的免疫平衡，Treg 细胞数量的降低或功能减弱会导致自身免疫耐受损伤、免疫功能紊乱并最终导致自身免疫疾病的发生。T细胞亚群在SAA 治疗中的疗效预测价值研究表明[21]，CD3+CD25+T 细胞比例能够作为SAA 疗效的预测性指标，其升高提示疗效较佳；CD3+CD25+T细胞比例大于3%提示预后较好和生存期较长。

CAA较SAA病情相对稳定，但CAA患者血象恢复过程中PLT 的上升最为缓慢，部分CAA 患者PLT 甚至终身未能复常[3]，若PLT 数量持续低下可出现尿血便血、皮肤粘膜或牙龈舌面出血、视网膜出血等多种出血表现并将严重影响患者生存质量，口腔内出血或眼底出血频发常提示颅内出血风险增加，因此探索和分析CAA 患者PLT 数量的影响因素具有重要的临床意义；由于PLT 数量与CAA 患者的出血症状和生存质量密切相关，通过预测PLT 数量在临床治疗后的转归有助于临床医师及时判断和评估CAA 患者在临床结局中的出血风险及其对患者生存质量的影响，有利于提高CAA 患者在临床治疗中的依从性。肾阳虚型是CAA 患者最为常见的中医证型，此证型CAA 患者经中西医结合治疗的总有效率最高[9，10]，因此本研究中纳入的病例均为肾阳虚型CAA 患者，在充分发挥中医药辨证论治优势的同时，又能够使研究成果具有更强的普适性。本研究发现肾阳虚型CAA 患者的外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞的比例每增加1%，PLT 平均降低5.104×109·L-1，提示T 淋巴细胞与PLT 之间呈负相关，证实了T 淋巴细胞介导的造血干/祖细胞（HSPC）免疫破坏在CAA 病理机制中的重要作用。本研究也发现CD3+CD25+T 细胞占淋巴细胞的比例每增加1%，PLT 平均升高23.851 × 109·L-1，与CD3+CD25+T细胞比例作为SAA 疗效的有利预测性指标的研究结论相一致[21]。本研究表明模型中引入的变量能够解释肾阳虚型CAA 患者PLT 数量变化的66%（调整R2=0.660），能够在临床上作为肾阳虚型CAA 患者PLT 数量变化的有效预测指标，即通过肾阳虚型CAA 患者的外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞的比例和CD3+CD25+T 细胞的比例能够估计和预测患者在未来的临床转归中PLT 的值及其变化趋势。譬如在外周血淋巴细胞中CD3+CD19-T 细胞的比例降低和CD3+CD25+T 细胞的比例增加将在很大程度上预示着该患未来PLT 有升高的趋势。根据PLT 的转归趋势，临床医师能够及时判断和评估CAA 患者在临床结局中的出血风险及出血症状对患者生存质量的影响，有利于提高CAA 患者在临床治疗中的依从性和坚定患者治疗信心。本研究纳入病例数仅22例，尚需进一步扩大研究对象样本数量以提供坚实可靠的数据支持和完善临床研究；肾阳虚型CAA 患者PLT 数量的其他潜在影响因素也有待进一步研究。