基于网络药理学研究瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的作用机制＊

谭雨晴，李 军，陈恒文

（1. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2. 北京中医药大学研究生院 北京 100029）

冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary atherosclerotic heart disease，CHD），是指由于冠状动脉发生粥样硬化病变致使血管管腔狭窄甚至闭塞，造成缺血缺氧损伤或坏死所致的心脏病[1]。目前，城乡居民因心血管疾病死亡原因仍占居首位，日趋明显的危险因素导致患病人数持续上增，根据推算我国心血管病目前患病人数2.9 亿，其中冠心病高达1100 万[2]。结合既往防治策略，注重二级预防和心脏康复，以综合防控[3]。现代医学干预冠心病主要有药物、介入和外科手术等方法[4]，对于患者的症状有极大的改善。中医药干预冠心病也具备其特有优势，如干预不能血运重建的冠心病及支架术后再狭窄等问题，也可以改善心功能、缓解缺血缺氧损伤、预防再狭窄、调节心率[5]。病证结合的模式融合了现代医学的辨病和传统医学的辨证，可以贯穿整个疾病发展过程，准确对疾病的因、性、位、势做出综合判断[6-7]。中医学认为，冠心病属于“痹”的范畴，病位在心，与其他脏腑密切相关，本虚标实，本虚有气虚、阳虚、阴虚等；标实者为血瘀、痰浊、寒凝、气滞等，为标，冠心病缓解期，痰瘀来疾去缓，聚湿成痰，胶着互结，疾病迁延不愈；元气亏虚，无力行血亦可致痰瘀。痰瘀贯穿疾病发展历程，痰瘀互结是常见证型[8-9]。

瓜蒌薤白半夏汤方出《金匮要略》，专为胸痹心痛而设，具有通心阳，散瘀滞、化痰湿、止痹痛的功效[10]。目前对于瓜蒌薤白半夏汤以单味药或者药对的作用机制研究较多，复方研究多以临床研究为主，药物作用机制尚未深入[11]，对于经典名方的开发利用造成了极大的阻碍。网络药理学的提出为中药复方作用机制研究带来了新的灵感与方法[12]。网络药理学借助于计算机系统，立足于疾病、单药大数据的优势，对中药、化学成分、靶点信息、信号通路进行整合分析，与中医复方整体调节，同病异治，异病同治的思想不谋而合[13]。基于此，本研究拟借助网络药理学的研究方法，构建“中药-化合物-靶点-疾病”的网络，初步分析瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的潜在作用机制，从复合网络、生物功能、通路、分子等多个层面系统研究，为深入研究瓜蒌薤白半夏汤的实验机制研究提供基础和方向。

1 研究方法

1.1 瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分获取

检索中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（https://tcmspw.com/index.php，Version 2.3），获取瓜蒌薤白半夏汤的主要药物的作用成分，分别收集瓜蒌、薤白、半夏的化合物，设定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 且类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，避免部分有效成分因不满足OB 和DL 值设定条件被剔除，通过检索论文查阅中国药典对有效成分进行补充，检索数据库以“中国知网”（https://www. cnki. net/）、“ 万 方 数 据”（http://wanfangdata.com.cn/index.html）为主，阅读筛选文献，提取瓜蒌薤白半夏汤干预心血管疾病的有效成分，汇总建立瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分数据库。

1.2 瓜蒌薤白半夏汤有效成分靶点预测

基于TCMSP平台相关靶点预测功能，查找瓜蒌薤白半夏汤主要成分所对应的靶点信息，登陆Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库，筛选物种信息为“homo sapiens”的数据，校正获取的靶点蛋白，并将其转换为标准基因名，创建瓜蒌薤白半夏汤靶点数据库。

1.3 冠心病疾病靶点获取

GeneCards 是一个集成数据库，可检索提供丰富的人类基因数据，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/，Version 5.0），以“coronary heart disease（冠心病）”为关键词进行检索，查找冠心病相关基因，导出Excel格式，筛选Relevance score（相关度）≥30的基因，创建冠心病疾病靶点数据库。

1.4 瓜蒌薤白半夏汤靶蛋白PPI网络构建

使用Cytoscape 3.7.2 软件，将各化合物与对应的靶点进行关联，构建“药物-有效成分-作用靶点”网络，合并瓜蒌薤白半夏汤靶点数据库与冠心病疾病靶点数据库，取交集，创建“成分-共同靶点”网络；将交集 靶 点 导 入STRING（https://string-db.org/，Version 11.0）数据库，选择“homo sapiens”筛选，设定置信度为中等0.400，构建PPI 网络，分析其网络拓扑参数，得到关键靶点。

1.5 相关生物功能注释和通路分析

为分析瓜蒌薤白半夏汤发挥药理作用的主要信号通路及生物过程，将瓜蒌薤白半夏汤与冠心病映射靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）生物信息平台，对其进行GO（Gene ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，以P值作为条件，筛选作用靶点可能参与生物学的途径及通路，探讨瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病可能的作用机制。

1.6 瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分与靶蛋白的分子对接

利用Uniprot 数据库和RCSB PDB 蛋白质结构数据库（https://www.rcsb.org/）查找关键靶点的PDB ID（Protein Data Bank Identification），获取蛋白信息，利用Pymol 软件处理分子结构，保存为pdb 格式。在TCMSP 数据库下载靶点对应的药物有效成分信息，保存为mol2 格式。利用SYBYL-X 2.0 软件进行分子对接，通过获取的Total score分析结果。

1.7 瓜蒌薤白半夏汤作用机制文献验证

检索国内外数据库，查找瓜蒌薤白半夏汤干预冠心病相关研究的可能机制，为网络药理学分析提供文献支撑。

2 结果

2.1 瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分获取

通过TCMSP 检索瓜蒌薤白半夏汤各药物的化学成分，其中瓜蒌相关的化学成分11 个、薤白相关的化学成分11 个、半夏相关的化学成分13 个，结合药典，增加了琥珀酸这一有效成分，检索文献对成分进行补充，补充瓜蒌[14-15]5个有效成分如下：4-羟基-2-甲氧基苯甲酸、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、油酸、β-谷甾醇，薤白[16-17]补充5 个有效成分，薤白苷a、薤白苷d、薤白苷e、薤白苷f、腺苷，半夏[18-19]补充3 个有效成分，麻黄碱、胆碱、腺苷，去除重复项，共得到46个化合物，其中腺苷为薤白、半夏共有的成分，β-谷甾醇为瓜蒌、薤白和半夏所共有的成分（表1）。

2.2 瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分-靶点网络

通过TCMSP 数据库共检索出瓜蒌薤白半夏汤各成分对应的靶点605 个，并通过Uniprot 数据库予以校正，去除重复，最后获得277 个靶点。绘制“瓜蒌薤白半夏汤-活性成分-药物作用靶点”网络图，图中活性成分取MOD ID 后5 位数字表示，共有326 个节点586条边（图1）。

图1 瓜蒌薤白半夏汤-活性成分-药物作用靶点网络图

2.3 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病潜在作用靶点预测

图2 瓜蒌薤白半夏汤与冠心病靶点韦恩图

表1 瓜蒌薤白半夏汤活性成分基本信息表

利用GeneCards 数据库查找冠心病相关基因，根据1.3 中所提及的筛选条件进行筛选，最后获取了450个疾病靶点，与瓜蒌薤白半夏汤主要活性成分靶点取交集，得到82 个共同靶基因（图2）。利用Cytoscape 3.7.2 对瓜蒌薤白半夏汤活性成分治疗冠心病作用靶点的对应关系进行可视化处理（图3）。分析可知，网络图有114 个节点、200 条边，节点度值（Degree）可以反应该节点在网络中的重要性，利用度值反应网络图中各节点面积大小，面积与度值成正比；就药物成分而言，槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、油酸（MOL000675）、柚皮素（MOL004328）、β-谷甾醇（MOL000358）、黄 芩 素（MOL002714）、卡 文 定 碱（MOL002670）与多个靶点关联，可能是瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的主要活性成分。前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、β-2 肾上腺素能受体（ADRB2）、钠通道蛋白5型亚基α（SCN5A）、半胱天冬酶3（CASP3）、核受体 亚 家 族3 组C 成 员2（NR3C2）、雄 激 素 受 体（Androgen receptor，AR）可能是网络的核心节点，与多个化合物有靶向关系。

图3 中药化合物-作用靶点网络图

2.4 瓜蒌薤白半夏汤PPI网络构建

登陆STRING 数据库，输入82 个交集靶点，构建PPI 网络图（图4）。图中82 个潜在靶点均有相互作用，1538 条边表明了各个蛋白之间的作用。平均度值为37.5，高于平均度值的靶蛋白有45 个，关联度排名前10 的分别是：胰岛素（Insulin，INS）、白介素-6（Interleukin-6，IL6）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、血管内皮生长 因 子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、C-C 基序趋化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、表皮生长因子（Pro-epidermal growth factor，EGF）、白介素1β（Interleukin-1 beta，IL1B）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP9）、内皮型一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase，endothelial，NOS3），这些靶蛋白在整个蛋白相互作用关系中出于关键地位，可能是瓜蒌薤白半夏汤干预冠心病的重要靶标。

2.5 相关生物功能注释和通路分析

对瓜蒌薤白半夏汤和冠心病的交集靶点进行富集分析，包括生物学过程（Biological function，BP）、细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三个方面，以P＜0.01 进行筛选，获取生物学过程266 个条目，主要涉及RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、转录正调控，DNA 模板、药物反应、基因表达的正调控、信号转导、缺氧反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控、炎症反应等；细胞组分包括24个条目，主要涉及细胞外间隙、质膜、胞外区、胞质、细胞外泌体、细胞表面、细胞质核周区、内质网等；分子功能包括41个条目，主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质同源二聚体活性、细胞因子活性、受体结合、转录因子活性等，以基因富集数目降序排列，各选取3个方面排序前10 的条目，P值取负对数，绘制条形图（图5）。对瓜蒌薤白半夏汤和冠心病的交集靶点进行通路富集分析，有112 条通路与之相关，以P＜0.05 并且基因数目大于等于10 进行筛选，得到30 条通路。主要包括癌症相关通路以及PI3K-Akt 信号通路、HIF-1信号通路、TNF 信号通路等。以富集数降序排列，选取前20项条目，绘制气泡图（图6），图中将P值取负对数，颜色表示P值大小，基因数目以气泡面积表示。

图4 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病靶点PPI网络图

图5 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病靶点富集分析图

图6 瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病KEGG分析气泡图

2.6 瓜蒌薤白半夏汤有效成分与疾病靶点分子对接分析

选取PPI 网络中5 个关键靶点：INS、IL6、AKT1、TNF、VEGFA，获取PDB ID 和靶点结构，将5 个靶点分别于其相对应的有效成分进行对接，靶点与化合物结构结合时，对接分数越高，靶点与化学物结合越稳定，能量最低（表2）。对接分数均高于4分，显示结合强度较好，其中得分高于7 分的有2 个，5-7 分的有7 个，提示核心靶点与瓜蒌薤白半夏汤有效成分具有较好的结合能力。化合物大部分与核心靶点以氢-氢键连接，以对接分数降序排列，前3 分别为：INS 与油酸在CYS6 处形成氢键；IL6 与木犀草素在ASN169、ASN145、SER37、ARG40、ASP34、GLN175处形成氢键；AKT1 与 槲 皮 素 在 GLU228、THR291、ASP292、ALA230、LYS179 处形成氢键，对接分数大于6 的对接结构图如下（图7）。

表2 核心靶点与药物成分对接分数

图7 分子对接模式图

2.7 瓜蒌薤白半夏汤干预冠心病文献验证

查阅文献发现，瓜蒌薤白作为经典药对，可用于治疗心肌缺血、再灌注损伤、心肌纤维化、动脉硬化、高脂血症，其作用机制可能与抑制氧化反应、下调自噬基因、抑制成纤维细胞增殖、改善血液流变性、增强巨噬细胞吞噬作用、调节脂蛋白水平有关。通过抑制p53、casepase-3 表达，调节Bcl-2/Bax 的水平，抑制心肌细胞凋亡，以保护心肌[20]。瓜蒌薤白半夏汤还可以抑制缺血再灌注的炎症损伤，减少IL-6、IL-1β的产生，促进IL-10 的表达。通过抑制NF-κB，调节IL-1、IL-6、TNF-α的表达，保护心肌再灌注损伤[21]。综上，已有的实验研究也一定程度上说明了瓜蒌薤白半夏汤通过抗炎、抗氧化、抗纤维化、降脂等作用干预冠心病。

3 讨论

瓜蒌薤白半夏汤是最为常用的“胸痹心痛”经方，其临床疗效已得到临床试验证实。一项纳入20 个随机对照试验1810 例患者的系统综述[22]显示，瓜蒌薤白半夏汤加减方可提高冠心病心绞痛患者的心绞痛、心电图和中医症候疗效，且安全性较好。本方也被纳入《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗指南》[23]，作为冠心病心绞痛痰浊闭阻证的首选方剂。然而，然而本方治疗冠心病的具体作用机制研究尚未阐明，利用网络药理学方法有助于系统分析本方与冠心病的作用关系，挖掘潜在的作用靶点。

本研究基于Cytoscape 3.7.2 软件建立“中药-作用成分-靶点-疾病”网络模型，共筛选出瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病的46 个活性成分、277 个靶点。对瓜蒌薤白半夏汤中药化合物-作用靶点网络图进行分析后发现，槲皮素、木犀草素、油酸、柚皮素、β-谷甾醇、黄芩素、卡文定碱等化学物在网络图占据重要地位，可能是瓜蒌薤白半夏汤发挥治疗作用的主要成分。研究表明，槲皮素可以改善动脉粥样硬化，可通过抗氧化，抗炎症作用进而减轻内皮细胞功能障碍[24]。此外还可以降血压，扩张血管，抑制血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖，对心脏具有保护作用[25]。

木犀草素可以保护肝脏和心血管，具有抗炎抗氧化的功能，促进免疫器官的分化，提高CD4+和CD8+T细胞水平，增强免疫力，作用机制可能与下调PI3K/AKT 通路有关[26]。油酸是重要的不饱和游离脂肪酸，游离脂肪酸，与动脉粥样硬化和糖尿病的发展密切相关[27]。柚皮素可以调节代谢，直接影响血管壁，可以预防内皮功能障碍具有明显抑制动脉粥样硬化作用，还具有降脂、降压、抗炎的特性[28-29]。β-谷甾醇是一种天然的抗氧化剂，可以保护氧化应激损伤，调节能力代谢，保护心肌[30-31]，抑制炎性因子的聚集和释放，增强阿司匹林的抗炎作用[32]。黄芩素可以通过作用于PI3K/Akt、MAPKs 和NF-κB/p65 信号通路，干预信号分子，保护心肌细胞缺血/缺氧损伤[33]。卡文定碱可抑制炎性因子，具有抗炎作用[34]。豆甾醇具有广泛的生物学活性，是一种天然的抗炎抗氧化剂，有镇痛、降脂、调节血糖的作用[35]。

预测瓜蒌薤白半夏汤与冠心病交集靶点82个，对靶点蛋白相互作用网络进行分析发现，瓜蒌薤白半夏汤可能通过作用于INS、IL6、AKT1、TNF、VEGFA、CCL2、EGF、IL1B、MMP9、NOS3、CASP3、MAPK1、EDN1、PTGS2、CXCL8、TP53、IL10 等蛋白发挥治疗作用。INS 可以提高葡萄糖代谢，从而发挥缺血缺氧心肌的保护作用，血糖升高作为心血管疾病的危险因素，胰岛素对于血糖的调节作用尤为重要[36]。IL6与冠状动脉粥样硬化发生和发展密切相关，它可以通过激活巨噬细胞、刺激巨噬细胞低密度脂蛋白受体的表达，促进泡沫细胞形成，并刺激基质金属蛋白酶合成，降低粥样斑块纤维帽的稳定性，导致斑块破裂[37]。AKT1 参与多种生物学过程，如细胞代谢、细胞存活、周期调控、转录调控等，在心血管疾病、炎症、癌症及糖尿病的发生发展中均可发挥作用[38]。TNF 与炎症反应关系密切，TNF-α刺激相关血管生长因子的表达，可促进缺血后血管再生[39]。VEGFA 涉及内皮细胞的血管舒张、增殖、通透性、迁移和存活，与血管生成密切相关[40]。瓜蒌薤白半夏汤作用于靶点可能与调节炎症因子，作用于血管内皮细胞、心肌细胞，参与氧化还原反应有关。

GO 功能分析结果提示，生物学过程对于基因的调控、信号转导、缺氧的反应、细胞增殖或凋亡过程的调节、炎症反应等均与冠心病联系密切；细胞组分主要涉及细胞外间隙、质膜、胞外区、胞质、细胞外泌体、细胞表面、细胞质核周区、内质网等；分子功能主要涉及蛋白质结合、酶结合、蛋白质同源二聚体活性、细胞因子活性等。富集分析进一步表示，瓜蒌薤白半夏汤作用于多层面通过复杂机制调节冠心病。

KEGG 分析结果提示，有5 条通路与心血管关系密切，PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、FoxO 信号通路。PI3K-Akt 通路在细胞存活、增殖、凋亡中起着关键作用，影响动脉粥样硬化的发展。作为通路，参与了细胞因子的信号转导，同时对能量代谢也有重要作用[41-42]。TNF 信号通路与炎症和免疫相关，TNF-α参与细胞生长、增殖、死亡等过程，协同IL-6、IL-1 等炎性因子导致心脏炎性反应[43]。HIF-1，可以调节缺氧引起的生理病理变化，如氧化应激、缺氧损伤、血管新生、炎症反应、代谢等，参与调控多种细胞的增殖、分化、凋亡[44]。MAPK信号通路有助于细胞各项生理活动，如转录、合成蛋白、细胞周期等，参与了血管内皮细胞炎症损伤，还可以调节泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成[45]。FoxO可以促进心肌细胞凋亡，抑制其表达可以助于心肌再生。FOXO1/3 可以抑制心肌纤维化，提示在早期可能起到保护心肌的功能，而在后期加速了疾病的发展进程[46]。

本研究存在一定的局限性，仅基于TCMSP数据库检索药物成分及靶点，中药数据库较多，数据日渐完善，TCMSP 作为综合考虑最优选的数据库之一仍然存在部分药物缺失、有效成分不全等问题，在今后的研究过程中，应尽量结合多个数据库及文献资料对数据进行补充。综上，瓜蒌薤白半夏汤治疗冠心病涉及多个有效成分、作用靶点及信号通路，与中药多成分、多靶点、多途径的特点吻合，瓜蒌薤白半夏汤具有的抗炎、抗动脉硬化、血管保护、抗缺血缺氧损伤等作用，一定程度上体现了其干预机制，为后续治疗冠心病的研究提供了新的理论基础和探索方向。