不同菌种发酵对大叶枸营养成分及有益菌含量变化的影响

孙宜新,胡 洪,吴学壮,闻爱友

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

大叶枸是近年杂交培育出的一种新型非常规饲草，具有较强的适应性和再生能力，且鲜草年产量大、蛋白含量高、营养丰富等特点[1]。因此，将大叶枸作为一种饲料资源合理开发利用，对扩大畜禽蛋白饲粮来源，缓解我国蛋白饲料资源短缺，降低畜禽生产成本，促进畜牧业可持续发展有着重要的意义。研究表明大叶枸的细枝条和树叶虽含有较高蛋白质和矿物质，但因其含有较高ADF和NDF，且适口性较差而直接影响其作为畜禽饲料的使用[2]。近年来，随着发酵技术和微生物添加剂在现代饲料生产中的开发应用，采用微生物制剂发酵处理，可有效降解植物性饲料的细胞壁和纤维素，改善饲料原料的适口性和营养价值[3-6]。本研究以大叶枸茎叶为底物，分别接种纯培养的乳酸菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌复合菌种，测定了不同菌种发酵前后大叶枸的营养成分及发酵后有益菌含量等指标，并分析了影响其变化的因素，旨在为大叶枸发酵合理筛选菌株及客观评价大叶枸营养价值提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料及菌种

新鲜整株大叶枸于2019年7月采自安徽圣达生态养殖有限公司，烘干粉碎至60目备用;乳酸菌和枯草芽孢杆菌均为安徽科技学院动物营养与饲料学实验室筛选保存菌种;蔗糖为市购。

1.2 试验分组与发酵

1.2.1 发酵底物组成及配制 将粉碎后的大叶枸粉、蔗糖、水按58%、4%、38%配比称量，蔗糖溶于水中，将蔗糖液喷洒在大叶枸粉上，充分混均后，将大叶枸混合物均分为4份，待用。

1.2.2 发酵方法 取一定量的枯草芽孢杆菌、乳酸菌按1∶1的比例先混合均匀成复合菌株菌粉，然后分别将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、复合菌株菌粉放入45 ℃温水中，活化2 h，制成菌液，调节pH值为6.5。

在上述每组份的大叶枸混合物中，C组(对照组)按0.1%添加不含任何菌种的蒸馏水，BB组和LB组分别按0.1%添加量接种活化后的枯草芽孢杆菌菌液(2×105CFU/g)、乳酸菌菌液(2×105CFU/g)，BL组按0.2%添加复合菌株菌液(2×105CFU/g)。

将4组大叶枸混合物充分拌匀后，放入密闭容器，封口并放置于30 ℃环境条件下，密闭厌氧发酵8 d。待发酵结束后，分别取一定量湿基态发酵产物用于测定pH值和有益菌含量，其余发酵产物在65 ℃环境下烘干取出，凉至室温后粉碎，待测。

1.3 测定指标及方法

发酵后样品中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、NDF、ADF、钙、磷等分别采用常规饲料分析方法测定；pH值采用精密pH计测定；发酵样品枯草芽孢杆菌、乳酸菌等按照GB/T 26428-2010和GB/T 4789.35-2016中规定的方法进行有益菌计数测定(CFU/g)。

1.4 数据统计

采用SPSS 19.0软件分析试验数据和差异显著性检验，结果用平均数±标准表示。

2 结果与分析

2.1 发酵前大叶枸原料的营养成分

将新鲜大叶枸截成1～2 cm小段，经65 ℃烘干，粉碎至60目后，分别测定各种养分指标。结果见表1。

表1 大叶枸原料常规营养成分含量Table 1 Content of conventional nutrition of big-leaf mulberry raw material

2.2 不同菌种发酵对大叶枸营养成分的影响

由图1可知，C组中除粗蛋白含量略有提高外，其它各养分含量与未发酵大叶枸原料均无明显变化。添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌促进了大叶枸发酵过程中CF、NDF和ADF的降解，在发酵结束时BL组中CF、NDF和ADF含量最低，且显著低于其它处理组(P<0.05)，BL组CF、NDF和ADF含量分别达到11.51%、23.16%和15.87%。与对照组相比，LB组中CF、NDF和ADF含量有所下降，但差异不显著(P>0.05)，而BB组中CF、NDF和ADF含量显著低于C组和LB组(P<0.05)。LB组和BL组粗蛋白含量显著高于C组和BB组(P<0.05)。可能是由于LB组和BL组中乳酸菌数量较多，形成酸性环境，减少了粗蛋白的分解。BL组粗蛋白的含量高于LB组，可能由于BL组中枯草芽孢杆菌数量较多，发酵前期消耗大量氧气，促进了乳酸菌的繁殖。

图1 不同菌种发酵对大叶枸粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量的影响Fig.1 Effects of different strains fermentation on CP, CF, NDF, ADF contents in citron注：不同小写字母表示不同菌种发酵后同一指标间的差异显著(P<0.05)。

2.3 不同菌种发酵对大叶枸pH及相关微生物的影响

由表2可知，与发酵前相比，对照组pH、枯草芽孢杆菌和乳酸菌含量差异均不显著(P>0.05)。相比于C组的pH值，BB组降低37.15%，LB组降低35.29%，差异均显著(P<0.05)；BL组的pH值降低40.87%，差异极显著(P<0.01)。BB组和LB组之间pH值差异不显著(P>0.05)。发酵结束时C组中枯草芽孢杆菌和乳酸菌含量、BB组中乳酸菌含量和LB组中枯草芽孢杆菌的含量较少，其有益菌含量的对数值均低于3.00。BL组中枯草芽孢杆菌含量比BB组提高13.10%，乳酸菌的含量比LB组提高8.57%，差异均显著(P<0.05)。

表2 不同菌株发酵对大叶枸pH及相关微生物的影响Table 2 Effect of fermentation of different strains on pH and related microorganisms of big-leaf mulberry

3 讨论与分析

CP含量是指示饲料质量的关键指标，其含量越高，发酵饲料饲用价值越高。试验表明，大叶枸发酵添加乳酸菌处理组CP含量高于其它组。这可能是由于发酵料中添加数量较多的乳酸菌在发酵前期快速增殖，并利用底物中可溶性碳水化合物转化形成乳酸，使pH值迅速下降，减少了CP的分解[7]。发酵结束时BL组CP含量高于LB组，可能是由于BL组中枯草芽孢杆菌数量较多，发酵前期消耗大量氧气，促进了乳酸菌的繁殖，进而减少了CP的分解。这与本试验发酵结束时BL组中乳酸菌数量高于LB组结果一致。郁冯艳等[8]在使用乳酸菌制剂青贮甜高粱的研究中发现，乳酸菌制剂可有效提高CP含量。姚焰础等[9]研究发现添加乳酸菌制剂在抑制其它有害细菌增长的同时，可利用发酵底物合成自身的菌体蛋白，使得发酵后CP含量升高。与本试验结果相似。

CF、NDF和ADF含量是影响饲料可消化性的关键指标，其含量越低，发酵饲料饲用价值越高[10]。本试验中，发酵结束时BB组和BL组的CF、NDF和ADF含量显著低于C组。由于枯草芽孢杆菌在发酵时能分泌大量的胞外酶，如纤维素酶、淀粉酶等，能有效降解植物性饲料中的CF、NDF和ADF。熊罗英[11]利用HS3和GZ3两种枯草芽孢杆菌发酵构树叶，发酵后构树叶中的CF含量分别降低11.68%和14.96%，与本试验结果相似。Jones等[12]研究表明，在紫花苜蓿青贮过程中，细胞壁组分发生了变化，并且由于酸解作用使部分细胞壁多糖发生了降解。但这种在较低的pH值的酸性环境促进了细胞壁成分的酸解作用，与添加枯草芽孢杆菌对植物纤维降解的作用相对较弱，这可能也是试验观察到LB组与对照组中CF、NDF和ADF含量变化较小，而添加BB组和BL组明显降低的原因所在。

pH值是决定发酵能否成功最直接的指标。试验表明发酵8 d后，添加不同微生物菌剂的试验各组均较对照组pH值显著降低，且均降至4.18以下。这与侯楠楠等[13]使用乳酸菌发酵豆粕对pH影响的研究和刘晓明[14]使用乳酸菌、枯草芽孢杆菌发酵不同饲料原料对pH的影响的研究结果相符合。研究表明添加乳酸菌促进了乳酸发酵可直接降低了pH值；枯草芽孢杆菌在好氧发酵过程中产生降解复杂碳水化合物的酶，将葡萄糖或乳糖转化成乳酸等有机酸，使发酵后pH值下降。

本试验中复合菌种发酵组比单一菌种发酵组的有益菌含量分别提高11.59%和7.89%。这与李可义[15]的添加芽孢杆菌和乳酸菌处理组的乳酸菌含量显著高于单独添加乳酸菌处理组的结果相一致。汤小朋[16]在单菌和混菌两种方式固态发酵木薯渣的研究中发现，单菌发酵后活菌含量低于混菌发酵。这是因为枯草芽孢杆菌和乳酸菌具有抑菌作用，能抑制有害菌的增长，利于发酵饲料的保存，且在发酵前期枯草芽孢杆菌生长繁殖消耗大量氧气，能促进乳酸菌的生长繁殖。徐颖宣等[17]、GE等[18]和Zhou等[19]研究指出在单菌发酵时，微生物的代谢产物将大量积累，会负反馈阻止酶类的合成，导致单菌发酵效果低于混菌发酵，而利用混菌发酵可以解除这种负反馈。

综上所述，添加枯草芽孢杆菌、乳酸菌及二者混合菌均可降低发酵物pH值，且混合菌添加优于单独添加对大叶枸粉发酵产物的营养成分含量影响的效果，明显改善了大叶枸发酵饲料的品质。