小麦高分子量谷蛋白亚基缺失品质效应研究进展

张 晓 李 曼 陆成彬 吴宏亚 江 伟 高德荣 ，2

（1江苏里下河地区农业科学研究所/农业农村部长江中下游小麦生物学与遗传育种重点实验室，225007，江苏扬州；2扬州大学/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，225009，江苏扬州）

小麦籽粒蛋白按功能可分为代谢蛋白和贮藏蛋白，代谢蛋白包括酶蛋白、水溶性的清蛋白、盐溶性的球蛋白等；贮藏蛋白包括麦醇溶蛋白（gliadins）和麦谷蛋白（glutenins）2大类，约占籽粒蛋白总量的85%。麦谷蛋白分为高分子量麦谷蛋白亚基（high-molecular-weight glutenin subunit，HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（low-molecular-weight glutenin subunit，LMW-GS）。HMW-GSs只占麦谷蛋白的7%～15%[1-2]，但可解释45%～70%面包品质的变异[3-5]。

HMW-GS由染色体1A、1B和1D长臂上的位点控制，总称为Glu-1位点，分别用Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1表示[6-8]。其中每个位点都有2个紧密连锁的基因，分别控制分子量较高的X-型亚基和分子量较低的Y-型亚基。理论上，每个小麦品种存在6个高分子量谷蛋白亚基，但1Ay亚基通常不表达，其他位点亚基也有不表达的情况，所以在六倍体小麦中一般存在3～5个HMW-GS[6-8]。然而人们普遍重视通过聚合优质HMW-GS进行强筋小麦制品面包品质的改良，却对HMW-GS缺失在弱筋小麦制品饼干、糕点或其他特色食品品质改良上可能具有的重要应用价值重视不够。本研究对小麦HMW-GS缺失的类型、机制和品质效应进行综述，以期为不同HMW-GS位点品质效应的研究和HMW-GS缺失在小麦品质改良中的应用提供参考。

1 HMW-GS缺失类型及机制

1.1 HMW-GS的多态性

在普通小麦中，HMW-GS基因3个位点所编码的亚基类型都存在着多态性。Glu-A1位点常见的有1、2*和 Null亚基；Glu-B1位点有 7、7+8、7+9、6+8、20、13+16、13+19、14+15、17+18、21和22等位变异组合，其中7+8、7+9、17+18、20和13+16等位变异较为常见；Glu-D1位点有2+12、3+12、4+12、5+10、2+10、2.2+12和2+11亚基。对于面包烘烤品质[4，9-12]，Glu-A1位点l和2*优于Null；Glu-B1位点7+8、17+18、13+16和14+15优于其他亚基；Glu-D1位点5+10优于2+12。

1.2 HMW-GS缺失类型

自然界天然存在的HMW-GS缺失材料很少。普通小麦中1Ay亚基通常不表达；Glu-D1编码的HMW-GS仅有极少缺失。刘悦等[13]发现四川白麦子地方品种“奉节罗汉麦”Glu-D1x亚基缺失；董永梅等[14]在小麦地方品种红花须须麦中检测到了Glu-D1y亚基缺失；杨恩年等[15]在普通小麦中检测到Glu-A1和Glu-B1编码的HMW-GS共同缺失。Lawrence等[16]利用缺失系Olympic（GIu-B1位点缺失）和Gabo（Glu-A1和Glu-D1位点缺失）创造出HMW-GS表达数量由5到0的品系，形成了分别单独缺少Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，共同缺少Glu-A1和Glu-B1、共同缺少Glu-A1和Glu-D1以及同时缺少Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点亚基的株系。Payne等[6]获得了一套类似的缺失突变体材料，HMW-GS数量从5到2。国内外研究人员陆续利用化学诱变、辐射处理、离子束辐射诱变或转基因方式获得了大量HMW-GS突变体。

1.3 HMW-GS缺失机制

正常表达的HMW-GS基因编码区均无内含子。HMW-GS的DNA编码序列由4个区域组成：（1）信号肽序列，起始密码子开始的一段63bp的核苷酸序列；（2）无重复的5ʹN-末端；（3）中央重复区，基因DNA序列长度的差异，主要由基因中部重复序列大小及重复次数不同引起，其变异由该区域内DNA序列的插入或缺失造成[17]；（4）无重复的3'C-末端。2个紧密相连的终止密码子TGATAG终止编码。由HMW-GS的DNA序列推导出的氨基酸序列可以看出，成熟高分子量谷蛋白亚基包括3个区域：N-端非重复区，由81～104个氨基酸组成；高度重复的中央区，由400～670个氨基酸组成；C-端非重复区，由42个氨基酸组成[5]。

在HMW-GS基因编码区，已报道3种方式可导致HMW-GS基因沉默。一是转座子插入导致编码失活，如Gu等[18]报道8.6kb LTR Retrotransposon的插入导致1Ay基因沉默。二是编码区出现提前终止密码子。普通小麦中1Ay基因沉默是终止密码子提前出现的结果[19]。小偃54的1Bx14缺失后基因长度同野生型一致，但在1 402bp处C转化为T，在基因的中间重复区引入1个终止密码子[20]；小偃54的1By15缺失后基因长度同野生型一致，在核苷酸序列上与野生型有1个碱基的差异（C1780 T），在基因的中间重复区引入1个终止密码子[21]。HMW-GS基因中C突变成T（CAA---TAA）会导致亚基发生沉默；在小麦高分子量麦谷蛋白基因中，由三联体密码CAA或CAG编码的谷氨酰胺（Gln）残基比例高达30%～35%，这2个三联体密码如发生C→T的单核苷酸替换都会突变成终止密码子TAA或TAG。提前终止密码子在小麦HMWGS基因沉默中扮演重要角色，而且该沉默机制都是由C→T单核苷酸替换造成。有些研究者也提出了其他的机制。Yuan等[22]研究表明，1By亚基缺失突变体云南铁壳麦（AS332）和西藏半野生小麦（AS908）由于编码Gln的三联体密码CAA缺失了1个A，导致核苷酸序列发生移码突变，致使在编码区的下游出现多个提前终止密码子而使基因沉默。1Bx7亚基序列在55bp处缺失1个碱基A，导致在273bp处出现终止密码子TGA，蛋白翻译提前终止，进而出现1Bx7亚基缺失[23]。郑雯[24]发现野生二粒小麦D1的Ay基因的编码区仅在N-末端出现唯一的提前终止密码子，而非出现在中央重复区；野生二粒小麦D100的Ay基因序列编码区451bp处却发现提前终止密码子是由A-T的单核苷酸替换所致，即三联体密码AAA突变成终止密码子TAA。三是较大DNA片段缺失。李宁[25]研究表明，1Dx2+1Dy12亚基缺失突变体Glu-D1位点附近较大DNA片段缺失导致了1Dx2+1Dy12蛋白亚基完全缺失。

2 HMW-GS缺失对贮藏蛋白组分和蛋白体发育的影响

Uthayakumaran等[26]研究表明，HMW-GS三位点全缺失系的蛋白质含量无显著变化，但单体蛋白含量增加30%，不溶性蛋白含量下降。Don等[27]研究认为谷蛋白大聚合体（glutenin macropolymer，GMP）含量和粒度随HMW-GS亚基数目减少而降低。张平平等[28-29]和张纪元等[30]对多份HMW-GS单位点或双位点缺失材料研究表明，Glu-1位点缺失小麦籽粒中不溶性谷蛋白聚合体（UPP）含量降低，HMW-GS/LMW-GS比率下降；同时利用EMS诱变处理宁麦9号获得不同单亚基缺失突变体，结果表明，GMP含量、谷蛋白/醇溶蛋白和HMWGS/LMW-GS比值较野生型降低。Ma等[31]利用病毒诱导产生了1Bx14亚基沉默材料，其总蛋白含量、谷蛋白含量和GMP含量均显著降低。Zhu等[32]研究了HMW-GS与蛋白体形成的关系，表明HMWGS数量越多，蛋白体数量也越多，同时蛋白体直径与HMW-GS表达水平有关，低HMW-GS含量材料的蛋白体颗粒较小，如HMW-GS全缺失材料中蛋白体直径不大于6μm。Liu等[33]和刘会云等[34]研究表明，1Bx20和1By20缺失对胚乳蛋白体形成没有明显影响，但一定程度上刺激了多数蛋白质合成和加工相关基因表达，保证了种子内蛋白含量、蛋白体外形和大小基本不变，表现负反馈调节效应。Gao等[35]研究发现1Ax1或1Dx2缺失后谷蛋白聚合体积累率降低，导致谷蛋白聚合体快速积累时期至少推迟10d，最终成熟籽粒中不溶性谷蛋白大聚体百分比较低。Yang等[36]报道Glu-A1、Glu-B1或Glu-D1分别缺失后HMW-GS和LMW-GS含量均降低，而醇溶蛋白含量升高。

综上所述，HMW-GS单亚基、单位点或多位点缺失后，谷蛋白聚合体合成积累延迟，蛋白体颗粒变小，谷蛋白聚合体数量和粒度均降低，谷蛋白/醇溶蛋白和HMW-GS/LMW-GS比例降低。谷蛋白主要以聚合体形式存在，HMW-GS和LMW-GS通过分子间二硫键形成聚合体，其中HMW-GS主要以线性主链结构存在，而LMW-GS则以支链形式存在，在面团形成过程中分子间二硫键进一步交联形成纤维状大分子聚合体，成为面筋和面团的骨架结构[37-40]。由此推测，HMW-GS缺失后，形成谷蛋白聚合体的主链减少，进而影响了HMW-GS聚合体形成，最终导致谷蛋白聚合体含量和粒度降低。

3 HMW-GS缺失对面粉和面团品质的影响

Uthayakumaran等[26]研究表明，与对照相比HMW-GS全缺失转基因系的面筋强度显著降低，揉混仪峰值高度和峰值宽度大幅下降，拉伸阻力和延伸度等拉伸仪参数也显著降低。李宁[25]在冀92-3235幼胚组织培养过程中进行辐射处理，筛选到1Dx2+1Dy12亚基缺失突变体，与对照相比其粗蛋白质含量没有明显变化，湿面筋几乎洗不到，只在网筛上有少量残留，Zeleny沉降值下降一半。Ram等[41]研究了Glu-A1和Glu-D1位点双缺失的印度小麦地方品种，其沉淀值降低、粉质仪形成时间缩短。Yue等[42]和武茹[43]通过RNAi技术获得1Dx5亚基完全不表达转化株系，其HMW-GS含量、面筋指数、Zeleny沉淀值、粉质仪形成时间和稳定时间均显著降低。Mondal等[44]研究认为Glu-A1和Glu-D1两位点共同缺失揉混仪峰值时间和峰值高度显著降低，面团弹性降低，延展性增加。含有1Bx7亚基种质材料的吸水率、湿面筋、蛋白含量、稳定时间、形成时间和沉降值等明显高于1Bx7亚基缺失材料[23]。Zhang等[45]利用离子束诱变小偃81产生HMW-GS 3个位点Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1分别单独缺失的材料，其中Glu-A1基因型SDS沉淀值、粉质仪和揉混仪特性比对照小偃81略有增加，Glu-B1和Glu-D1基因型SDS沉淀值和面团质量比对照小偃81显著降低，以Glu-D1下降幅度最大。张平平等[28-29]利用不同HMW-GS缺失突变体研究表明Glu-A1单缺失、Glu-D1单缺失以及Glu-A1和Glu-D1双缺失显著降低了面团弹性，提高了面团延展性；同时利用EMS诱变处理宁 麦 9号 产 生Glu-A1x、Glu-B1x、Glu-B1y、Glu-D1x和Glu-D1y缺失系，经研究缺失材料的蛋白质含量、籽粒硬度和溶剂保持力等籽粒品质未显著改变，但揉混仪形成时间、峰值高度和8min带宽均显著降低，以Glu-B1x和Glu-D1x缺失型表现最低。Zhang等[46]利用近等基因系研究表明，与野生型（1、7+8、2+12）和Glu-A1位点缺失（Null、7+8、2+12）基因型相比，Glu-D1位点缺失（1、7+8、Null）基因型SDS沉淀值、乳酸SRC、面筋指数、粉质仪稳定时间和吹泡仪P值显著降低，但籽粒硬度、蛋白质含量和水SRC均无显著变化。

综上所述，HMW-GS缺失后面团强度和弹性降低。在HMW-GS不同位点缺失类型中，以Glu-D1位点缺失面团强度和弹性下降最大，其次是Glu-B1位点，Glu-A1位点缺失面团强度变化不大或略有增加，进一步说明Glu-D1位点对品质的贡献最大。面团形成过程中，面粉经水化后HMW-GS和LMW-GS通过分子间二硫键作用形成纤维状谷蛋白聚合体构成面筋的骨架，醇溶蛋白则在分子内二硫键的主要作用下形成球状结构，通过非共价键与麦谷蛋白结合，充填在纤维状大分子聚合体中，谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋，赋予面团粘弹性[39，47]。由此推测，HMW-GS缺失后，用以形成谷蛋白聚合体的主链结构减少，谷蛋白聚合体积累下降，面团骨架结构变弱，进一步造成了面团强度和弹性降低。

然而上述多个研究表明，HMW-GS缺失后蛋白质含量、硬度和吸水特性并无显著变化。蛋白质含量无显著变化可能与谷蛋白和醇溶蛋白的补偿效应有关，谷蛋白积累含量降低，醇溶蛋白含量补偿增加，最终蛋白质含量无显著变化[36]。籽粒硬度无显著变化，这可能是由于小麦硬度和HMW-GS属于完全不同的基因，籽粒硬度由位于5D染色体短臂的主效基因控制，而HMW-GS由染色体1A、1B和1D长臂上的位点控制[48]。吸水特性与硬度密切相关，HMW-GS缺失后籽粒硬度无显著变化，吸水特性也相应变化较小[49]。

4 HMW-GS缺失对加工品质的影响

Lawrence等[16]研究发现Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1单位点缺失、双位点缺失或三位点缺失系的蛋白质含量无变化或升高，面包烘烤品质显著下降。Beasley等[50]研究报道，随着HMW-GS亚基缺失数目增加，面包高度极显著下降，鲜面条穿刺力极显著下降，但煮熟面条的剪切力和压缩力无显著变化。Uthayakumaran等[26]利用HMW-GS三位点缺失材料制作的面包体积非常小；墨西哥薄圆饼直径显著变大，可卷性和穿刺力下降。Mondal等[44]利用Glu-A1和Glu-D1两位点共同缺失且Glu-B1位点为17+18亚基的材料制作的墨西哥薄圆饼直径比HMW-GS不缺失亲本显著增大，但产品货架稳定性差、易碎；Glu-B1位点缺失，Glu-D1位点具5+10亚基或同时Glu-A1位点具有1亚基材料可改善墨西哥薄圆饼直径，同时具有较好的货架稳定性。Zhang等[51]研究表明，部分HMW-GS缺失类型（2*，17+_，5+_）和（2*，17+_，2+12）表现中等面团强度和强延展性，制作的馒头品质好；同时发现HMW-GS单亚基缺失系糖酥饼干直径较野生型显著增加[30]。Liu等[33]和刘会云等[34]报道1Bx20和1By20缺失引起面团和面包加工品质下降。Zhang等[46]利用近等基因系群体研究表明，与Glu-A1缺失和野生型（1，7+8，2+12）相比，Glu-A1、Glu-D1位点双缺失和Glu-D1位点单缺失均显著增加曲奇饼干直径和酥脆性。

综上所述，单个或多个HMW-GS位点缺失后面包烘烤品质均显著下降；Glu-A1和Glu-D1位点双缺失材料制作的墨西哥薄饼直径显著增加，货架稳定性差，易碎，Glu-B1位点缺失且Glu-D1位点具5+10亚基可改善墨西哥薄饼直径，同时具有较好的货架稳定性。Glu-B1x、Glu-B1y和Glu-D1y单亚基缺失或Glu-D1位点缺失显著增加饼干直径。Glu-B1或Glu-D1位点部分单亚基缺失材料制作馒头品质显著改良。

5 研究展望

综合上述研究，小麦HMW-GS缺失并未显著改变蛋白质含量和籽粒硬度；蛋白质含量无显著变化，可能与低分子量谷蛋白以及醇溶蛋白补偿升高有关[36]；籽粒硬度无显著变化，是由于小麦硬度和HMW-GS基因位于不同染色体[48]。小麦HMW-GS单亚基、单位点或多位点缺失后，GMP含量降低，谷蛋白/醇溶蛋白比例下降，HMW-GS/LMW-GS比率下降，面团强度和弹性降低；Glu-D1位点缺失面团强度和弹性下降幅度最大，其次是Glu-B1位点，Glu-A1位点缺失面团强度变化不大或略有增加。单个或多个HMW-GS位点缺失后面包烘烤品质均显著下降；Glu-A1和Glu-D1位点双缺失且Glu-B1位点携17+18亚基材料制作的墨西哥薄饼直径显著增加，但货架稳定性差，易碎，Glu-B1位点缺失且Glu-D1位点具5+10亚基可改善墨西哥薄饼直径，同时具有较好的货架稳定性；Glu-B1x、Glu-B1y和Glu-D1y单亚基缺失或者Glu-D1位点缺失显著增加饼干直径；Glu-B1或Glu-D1位点1或2个Glu-1y亚基缺失制作馒头品质显著改良。

不同研究所用HMW-GS缺失材料的遗传背景存在差异，在具体分析应用时需要考虑到HMWGS缺失与其他品质相关基因组合的影响。高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白和醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分，3种组分的亚基类型和含量，以及HMW/LMW和Glu/Gli比例与小麦加工品质密切相关[39，47]。此外，籽粒硬度也是影响面团和食品加工品质的重要因素[48-49]。当前多数HMW-GS缺失品质效应研究所用材料、遗传背景和亚基缺失类型不同，不同亚基缺失的品质效应研究结果存在差异，尤其不同HMW-GS缺失在食品中应用的探索较少，亚基缺失的品质效应及对食品品质的改良作用需进一步深入。因此，今后仍需在以下几方面进行研究：一是不同HMW-GS缺失在不同遗传背景下的品质效应，构建不同品质类型遗传背景和不同HMWGS缺失类型（单亚基、单位点和多位点）遗传群体进行品质研究，探明不同HMW-GS缺失与不同低分子量谷蛋白亚基、醇溶蛋白亚基和不同硬度基因型组合的品质效应；二是重点进行HMW-GS缺失对弱筋小麦制品品质效应的研究，筛选出对弱筋小麦制品品质改良效应最大的亚基缺失类型和遗传背景组合；三是研究不同HMW-GS缺失的遗传和生理机制，并开发相应分子标记；四是利用不同HMW-GS缺失基因型进行新型特色食品的研发并进行市场化开发。