猪流行性腹泻病毒新型检测方法的研究进展

李公美,李茂辉,钱爱东,单春兰,马红霞*

(1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 教研基地管理处,吉林 长春 130118；3.云南农业大学 动物科技学院，云南 昆明 650225)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种可引起出生仔猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的高度传染性肠道病毒。PEDV为套式病毒目、冠状病毒科、α冠状病毒属成员，为有囊膜呈皇冠状的单股正链RNA病毒，基因组长约2.8 kb，由3个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M和N)共同组成[1]。2010年后，PEDV突然在我国呈暴发性流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。随后该病在韩国、泰国、越南、美国、加拿大和墨西哥等国也相继暴发，致使数以万计仔猪死亡[2-3]。研究表明，本次暴发流行的是一种新型PEDV毒株，该变异毒株相比2010年以前流行的以CV777为代表的经典毒株在S基因有15个碱基的插入和6个碱基的缺失。然而，当前疫苗未能给猪群提供有效的免疫保护，因此，开发新型毒株疫苗和建立变异株快速准确的检测方法迫在眉睫。本文针对当前PEDV的检测方法进行综述，以期为变异毒株的诊断和防控提供最新且高效的检测方法。

1 分子生物学检测技术

1.1 RT-PCRRT-PCR是PCR技术的一种变形应用，广泛应用于RNA病毒的检测。RT-PCR检测技术作为最基础的核酸检测技术，比传统的其他方法敏感。因此， PEDV RT-PCR是应用最广泛的检测技术，被广大研究人员相继开展使用。胡丽萍等[4]为了实现对PEDV的实验室诊断，用PEDV N基因设计了1对特异性引物，建立了PEDV 一步法RT-PCR检测方法，该方法对常见猪病毒无交叉反应、重复性好、稳定高且最低可检测1 pg RNA，同时应用该方法对广西25个猪场采集的共计506份病料进行了检测分析，结果表明广西猪场存在较为严重的PEDV感染。据报道，PEDV在美国存在3种类型毒株(original US virulent、S-INDEL和S-197DEL)共同流行的复杂态势，LIU等[5]基于毒株在S基因S1区的差异设计3条上游引物和1条下游引物，建立了可区分检测美国不同毒株的RT-PCR检测方法，结果显示该方法有较好的特异性和敏感性,可以检测区分3种不同类型的美国毒株，证明其可应用于未来的PEDV分子流行病学调查。为了提高RT-PCR的检测敏感性及特异性，也有学者利用Nanoparticle加入RT-PCR反应，建立了Nanoparticle-assisted RT-PCR。相比传统RT-PCR方法，可提高10～100倍的敏感性，并且该方法可以有效区分野毒株和疫苗株[6]。随着纳米技术的应用及检测要求的不断提高，多种PCR优化及衍生方法被建立，如可同时检测并区分PEDV经典和变异毒株的Nano-nest-PCR方法及可实现PEDV与TGEV同时检测的双重nanoPCR等检测方法[7-8]。以上多种衍生的新型PCR检测方法，不仅显著地提高了PCR检测方法的敏感性，而且可对不同类型毒株进行鉴别及区分，为PEDV的诊断提供了可靠的检测方法。

1.2 实时荧光定量RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)作为1996年开发的第2代PCR技术，是当前广泛应用的核酸定量方法。该方法拥有比普通PCR等多种检测方法更好的敏感性和特异性，且可以进行核酸定量。因此，有学者建立了多种PEDV荧光定量PCR检测方法，有效的提高了检测的敏感性和时效性。当前PEDV在我国同时以经典和变异毒株共同流行的复杂态势，给PEDV的防控和精准诊断带来巨大的挑战。有研究根据此流行态势和real-time RT-PCR的技术优势建立了双重TaqMan real-time RT-PCR，该方法可同时扩增PEDV经典和变异毒株，并可依据荧光集团鉴别毒株类型，有较好的特异性和重复性且最低可检测10 copies/μL，是当前较为敏感且快速准确的PEDV检测方法[9]。MILLER等[10]利用1 064份直肠拭子对建立的分别检测N基因和S基因的real-time RT-PCR进行检测评价分析，结果显示N基因real-time RT-PCR在临界值Cq≤34.99时是一种方便、快速且灵敏的检测方法，证实real-time RT-PCR可以通过对猪直肠拭子的检测实现对PEDV急性感染的动态检测，为PEDV的早期诊断治疗提供有效的诊断工具。在新型PEDV暴发的早期建立了多种real-time RT-PCR检测方法，满足了对PEDV变异和经典毒株的检测及对PEDV急性感染的早期诊断[11-12]。real-time RT-PCR相比常规PCR方法检测灵敏度高10～100倍，交叉污染率低，动态检测范围大且具有高通量的扩增能力及精确的靶基因定量检测能力。但是，real-time RT-PCR因需要昂贵的实验仪器，高昂的检测成本及专业的操作人员而不能大范围推广应用。

1.3 RT-LAMP环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者Notomi开发的一种简便、快速、准确和低价的核酸恒温扩增技术。LAMP检测技术在短时间内就应用到多种病原检测工作中，成为当前临床诊断常用方法之一。王伟等[13]在PEDVM基因设计引物建立了RT-LAMP检测方法，该方法在60℃下，60 min即可读取结果，该方法特异性好，最低可检测1×102copies/μL，同时在反应结束后加入SYBR GreenⅠ，在紫外灯光下，阳性样品呈绿色荧光，因此RT-LAMP方法因其快速简便将在PEDV临床检测中获得广泛的应用。YU等[14]为了在缺少设备的猪场实现快速检测，建立了一种real-time RT-LAMP检测方法，最低可检测0.07 PFU，比一步法RT-PCR敏感100倍，与real-time RT-PCR敏感性相当，因此该方法应用于临床猪场进行大规模PEDV诊断有非常好的前景。然而，在LAMP试验中与试剂一同孵育的染料如钙黄绿素和Picogreen等常常会引起假阳性结果，且在反应结束后开管添加SYBR GreenⅠ易引起交叉污染等问题，一直困扰LAMP的可视技术发展。因此，有学者针对以上问题，将RT-LAMP检测技术与垂直流(VF)核酸检测试纸条相结合，建立了RT-LAMP-VF PEDV检测方法，该方法通过将垂直核酸检测条置于可视化条带盒的密封塑料装置中以控制在扩增中的污染问题，该方法有较好的特异性，最低可检测10 pg核糖核酸，可在PEDV临床诊断中大范围应用[15]。

1.4 重组聚合酶扩增反应重组聚合酶扩增反应(RPA)是当前开发的最具前沿的恒温核酸扩增技术(INAT)之一。RPA相比传统PCR扩增方法差异在于其可在单一温度下快速的核酸扩增，操作步骤简便并可实现PON检测，是当前临床现场最快速的检测方法。吕继洲等[16]以PEDV M基因设计引物和探针建立了荧光RPA检测方法，该方法可在39℃ 20 min读取结果，敏感性可达10 copies /μL，可对血浆与血浆蛋白粉中的PEDV检测，该方法不仅可适用于PEDV的预防也是临床检测的高效新型检测方法。RPA可通过单链核酸重组酶、DNA单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶这3种酶，在无需仪器情况下利用体温进行核酸扩增，因此该方法将是PEDV临床现场检测中最具时效性且简便敏感的最新检测方法。

2 免疫学检测

2.1 ELISAELISA是免疫学检测中应用最广的检测方法之一，一直被作为血清学检测的金标准。ELISA检测方法是可进行大规模临床检测且价格低廉的检测方法，被广泛应用于血清学调查和抗体效价评估。赵玉龙等[17]为了评价猪血清中PEDV抗体水平，使用纯化的PEDV作为包被抗原，建立了检测PEDV血清抗体的ELISA方法，该方法不仅可通过D450值作为感染评判标准且通过抗体效价进行疫苗免疫效果分析，不仅作为猪场PEDV抗原检测方法也为PEDV疫苗免疫防控计划提供指导。王丽珍等[18]利用最新、抗原匹配性更好的疫苗强毒株SCh作为全病毒包被抗原，建立了阳性率检出更高，特异性更强的PEDV间接ELISA抗体检测方法，该方法对来自福建、广东和江西的74份血清样品进行检测，阳性率为84%，与商品化ELISA试剂盒的符合率为81%，因此该方法具备临床检测的可行性。当前，也有多种以PEDV S蛋白和N蛋白作为抗原建立的ELISA方法，但是相比以纯化的PEDV作为包被抗原的方法，产量低，有时表达的蛋白为包涵体且抗原位点单一，影响检测的特异性及阳性率的检出[19-20]。虽然ELISA检测方法不适用于急性感染的检测，但是其可通过抗体效价作为猪群防控及疫苗免疫效价进行评估，也是PEDV血清学调查最有效的检测工具。

2.2 免疫层析技术免疫层析技术是近些年国内外较为流行的一种快速诊断技术，其可利用胶体金或免疫酶等物质使抗体与抗原结合的特定区域显示不一样的颜色，从而实现特异性的诊断。该方法具有较好的特异性和敏感性且是一种简便易行的可实现现场诊断的快速检测方法，因此利用该技术开发的多种检测试纸条已被广泛应用于宠物医院、养殖场和检疫等部门。为了实现对PEDV急性传染病的早期快速检测，LYOO等[21]研发了一种免疫层析试纸条(ICA)检测猪粪便的拭子，该方法最低可检测104.0TCID50/mL，且与real-time RT-PCR相比ICA特异性和敏感性分别为98.6%和95%，样品检测一致性达100%，因此该方法可适用于猪场PEDV的临床诊断。汪怿旸等[22]通过对PH、抗体浓度和封闭时间等多种条件优化也同样建立了免疫胶体金试纸条检测PEDV，该方法可在10 min内判定结果，最低可检测310个TCID50病毒量。然而，相比适用免疫胶体金检测的PEDV抗原，有学者建立了可检测血清中PEDV抗体的免疫胶体金检测方法。LI等[23]利用纯化重组的PEDV N蛋白建立了检测猪血清中PEDV抗体的胶体金试纸条，且与商品化的ELISA试剂盒相比敏感性和特异性分别为96%和90.8%。综上分析发现建立的多种PEDV免疫胶体金试纸条可用于PEDV临床的快速诊断，并可协助PEDV感染的早期诊断及流行病学监测等研究。然而，免疫胶体金试纸条检测成本较高且不能区分当前流行的变异株，希望在未来的研究中能降低使用成本及开发出可检测变异毒株的多重条带免疫胶体金检测试纸条。

2.3 荧光微球免疫荧光微球免疫分析(FMIA)是将特定病毒抗原偶联至荧光微球，并通过使用生物素/链霉亲和素/荧光团检测系统(双重激光仪)检测抗原的特异性抗体，最终根据显示的中值荧光强度(MFI)读取血清中抗体的含量[24]。有研究利用PEDV N 蛋白建立了一种检测血清中PEDV特异性抗体的FMIA检测方法，并通过大量试验和临床样品进行反复检测评估，结果发现FMIA获得的结果与通过间接和阻断ELISA以及IFA测试获得的实验结果呈高度相关性(kappa>0.91)，且该方法具有较高的敏感性(98.2%)和特异性(99.2%)，通过对实验动物中血清IgG和IgM的动态监测发现PEDV的抗体最早在感染的6 d后产生，21 d时达到顶峰并可持续监测到43 d[24]。FMIA抗体检测方法相比最常用的ELISA方法有较高的灵敏度、样品检测数量多及可同时检测多种病原体抗体的优势，并且其在流体孵育中抗原包被的微球珠在溶液中呈三维空间暴露，抗体结合路径变短且通过激光仪代替酶标仪，因此试验及检测时间明显缩短。该方法也可根据疫苗株或野毒株蛋白的差异，开发出一种可区分疫苗株或野生毒株的检测方法，总之，FMIA作为新兴的抗体检测方法，相比当前的多种抗体检测方法具有明显的优势，将成为最具前景的抗体检测方法。

3 其他方法

随着检测技术的发展和临床检测试验要求的不断提高，研究者相继建立了多种新型PEDV检测方法满足当前临床及试验需求。如可实现疾病早期诊断的恒温隔绝式PCR(iiPCR)，采用靶向的PEDVS基因引物和探针建立了可临床现场快速检测的PEDV iiPCR检测方法[25]；IFA被应用于检测PEDV抗体，评价猪群免疫状态[26]；OKDA等[24]最近开发了一种使用荧光聚焦中和试验(FFN)检测PEDV，FFN可快速测量NAbs滴度，也有研究者使用优化的FFN试验可检测初乳和乳汁中的NAbs滴度[27]。因此，可根据检测的不同需要选择最有效的检测方法，并及时将最新的检测技术应用到PEDV临床检测及试验中。

4 总结

当前，PEDV是猪群中流行最广泛的肠道病毒，且同时存在经典与变异2种类型毒株，给防控及诊断带来严峻挑战，严重危害养猪业的健康发展。因此，科研人员不断的开发新型PEDV检测技术投入到实验研究和临床诊断，为PEDV的防控及发病机制研究提供最有效的检测方法。分子生物学检测方法可快速的实现鉴别诊断多种类型肠道病毒及区分PEDV经典和变异毒株，但是该方法需要昂贵的机器且多为实验室诊断技术，不能应用到现场检测。免疫学检测方法不仅为PEDV早期感染提供有效信息且可通过抗体评价疫苗的免疫效果，为PEDV疫苗防控提供有效的免疫计划。但是，免疫学检测技术不能检测到急性感染状态且耗时费力。然而，近些年新兴的RPA、免疫胶体金和FMIA检测技术的广泛应用，不仅满足了临床快速的定点诊断而且实现了大规模样品检测，虽然还存在检测成本高昂及技术复杂等问题，但为快速精准的PEDV诊断和控制病毒传播提供了可靠的检测技术。随着新型技术的不断运用，建立一种快速准确，价格低廉且可满足多种检测诊断需求的新技术，为PEDV的有效防控提供最有效的检测方法势在必行。