牛疱疹病毒1型诱发牛呼吸道综合征的研究进展

柳翠翠，于秀剑，杜万年，刘勃兴，张志强，吴同垒，史秋梅

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604)

牛疱疹病毒1型(BHV-1)是α疱疹病毒亚科成员，根据抗原和基因组分析确定可分为3个亚型，BHV-1.1(1),BHV-1.2a (2a)和BHV-1.2b (2b)。1型毒株是牛传染性鼻气管感染(IBR)的病原体，常在呼吸道和流产胎儿中发现。1亚型毒株在欧洲、北美和南美流行。2a亚型常与呼吸道和生殖道的广泛临床表现相关，如IBR、传染性脓疱外阴道炎(IPV)、传染性脓疱龟头炎(IPB)和流产。2a亚型在欧洲、巴西流行。2b亚型毒株与呼吸系统疾病和IPV/IPB有关，但与流产无关。2b亚型毒株的致病性低于1亚型毒株，通常在澳大利亚或欧洲分离到。

1 BHV-1引起的疾病及临床症状

在牛的养殖过程中，BHV-1的呼吸型最常见。而流产或生殖感染更为常见[1]。生殖器感染可在与受感染动物密切接触后发生。BHV-1的呼吸和生殖形式的潜伏期为2～6 d。在呼吸系统疾病方面，临床症状包括高烧、结膜炎伴流泪、鼻孔发炎、喉部因脓性物质堵塞而出现呼吸困难等。鼻部病变在鼻中隔黏膜上可见大量灰白色坏死灶。在没有细菌性肺炎的情况下，康复通常发生在临床症状出现后4～5 d。流产可能与呼吸道疾病同时发生，但也可能在感染后100 d内出现，这可能是由于潜伏期的重新激活。

生殖器感染最初的临床症状是尿频和轻微的阴道感染，然后黏膜表面出现糜烂和溃疡，公牛的阴茎和包皮也有类似的损伤。如果继发性细菌感染，可能在数周有炎症的子宫和短暂性不孕伴脓性阴道分泌物[1]。在没有细菌感染的情况下，动物通常在感染后2周内痊愈。不考虑继发性细菌感染，BHV-1在急性感染后建立终身潜伏期。

2 BHV-1诱导的免疫抑制与牛呼吸道疾病的关系

牛呼吸系统疾病(BRDC)，也被称为“运输热”，BHV-1通过短暂抑制受感染牛的免疫系统诱发BRDC，以及继发性细菌感染(例如溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和睡眠嗜血杆菌)，从而导致肺炎。继发性感染的易感性增加与BHV-1感染后细胞免疫功能低下有关，感染细胞的CD4+T细胞识别受到抑制，主要组织相容性复合体(MHC)I类和与抗原表达相关的转运蛋白的表达，CD4+T细胞功能在犊牛急性感染过程中受到损害，原因都是BHV-1感染CD4+T细胞并诱导其凋亡。在没有其他病毒基因的情况下，bICP0和UL41.5 2种病毒基因会抑制特定的免疫反应。

2.1 bICP0蛋白激活病毒基因表达，抑制干扰素(IFN)信号通路bICP0蛋白是主要的转录调控蛋白，因为它激活所有病毒启动子的表达[2]。在生产感染过程中，bICP0转录本呈结构性表达。由BHV-1和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)编码的ICP0同源基因在其各自的n端附近含有1个保守的C3HC4锌环。突变分析表明了C3HC4锌环指结构域对bICP0和ICP0的重要性。ICP0和bICP0与含早幼粒细胞白血病蛋白的原癌基因核区域共定位并破坏其结构。bICP0锌环的断裂阻止了简单病毒启动子的反式激活[3]，并破坏了将BHV-1 DNA转染到培养的牛肾细胞后bICP0刺激斑块形成的能力[4]。

bICP0蛋白包含2个转录激活域(TAD)和1个核定位信号(NLS)，这是高效转录激活所必需的[4]。与大多数转录因子不同，bICP0或ICP0与特定的DNA序列没有明显的结合，这表明bICP0通过与细胞转录机制相互作用来激活转录。

在没有其他病毒基因的情况下，blCP0抑制IFN信号。bICP0(直接或间接)降低人或牛细胞中IRF3 (IFN调节因子3)蛋白水平，从而导致IFN-β启动子活性降低[5]。此外，bICP0抑制IRF7激活IFN-β启动子活性的能力，但不会显著降低IRF7蛋白水平[5]。ICP0[6]和bICP0的环指蛋白是E3泛素连接酶，表明bICP0环指蛋白介导IRF3降解。功能蛋白酶对于bICP0诱导的IRF3降解是必要的[5],这一发现支持了bICP0环指蛋白介导IRF3降解的观点。环指蛋白并不是bICP0诱导的IRF3降解的唯一必要成分，因为bICP0 c端附近的特定突变也很重要[5]。需要进一步的研究来了解bICP0如何抑制IRF7诱导IFN-β启动子活性，以及bICP0诱导IRF3降解的机制。

病毒感染后，细胞蛋白激酶IKK-ε或TBK-1在IRF3的c端磷酸化丝氨酸残基，诱导IRF3同源二聚和核易位核IRF3与其他转录激活因子结合，直接结合和刺激IFN-P启动子活性。IRF3还可以直接结合多个一致的DNA结合位点，包括ISRE(IFN反应元件)，从而在没有IFN的情况下刺激IFN刺激基因的转录IRF3的激活是IFN反应的直接早期调控因子，而IRF7被认为是早期反应的一个组成部分。然而，在比较小鼠IRF3和IKF7敲除时，IRF7在抑制病毒感染方面更为重要[7]。因为BHV-1不会在小鼠体内生长，除非它们缺乏IFN受体，很明显，BHV-1有抑制先 d免疫反应的能力，如IFN，在牛和宿主的发病范围中是一种重要的因子。

2.2 UL49.5BHV-1 UL49.5开放阅读框(ORF)，也称为糖蛋白N(gN)，编码1种96-氨基酸蛋白，相对分子质量为9 000。UL49.5 ORF包含1个信号肽(n端22个氨基酸)、1个由32个氨基酸组成的胞外结构、1个由25个氨基酸组成的跨膜结构域和1个由17个氨基酸组成的长细胞质尾部。UL49.5蛋白表达为非糖基化I型膜蛋白。迄今为止，所有gN疱疹病毒同源物都与UL10 ORF编码的糖蛋白M(gM)形成复合物。PRV和BHV-1编码的gN同源蛋白抑制了转运蛋白相关抗原处理(TAP)介导的胞质多肽向ER的转运，从而阻断了含肽的三元MHCⅠ复合物在病毒感染细胞中的体外组装[8]。此外，BHV-1 gN针对TAP复合物进行蛋白酶体降解[9]。TAP复合物由TAPl/TAP2异二聚体组成，二者都属于ABC(ATP-binding cassette)。

TAP转运是MHCⅠ类抗原呈递的关键步骤。在缺乏功能性TAP转运体的情况下，大多数MHCⅠ类分子不含多肽。然而，它们被保留在内质网中，最终被蛋白酶降解。缺失胞质尾部的gN突变体仍可与TAP复合物结合，阻断肽转运，但该突变体的gN蛋白不能降解TAP[9]。但是，当除胞质尾部外的跨膜被截断时，gN不再阻断TAP功能[9]。因此，gN跨膜域中的序列可能与TAP相互作用。表达多种gN突变蛋白的病毒株的表型尚未在病毒和病毒感染细胞的环境中进行测试。综上所述，推测gN抑制TAP的能力是为了防止病毒感染细胞被CD8+T细胞杀死。

3 病毒编码的结构蛋白介导细胞进入及传播

为了充分了解BHV-1在BRDC中所起的作用，必须了解BHV-1是如何引发生产性感染。

α-疱疹病毒糖蛋白是病毒颗粒结合并穿透受纳细胞所必需的。此外，病毒糖蛋白是病毒释放、细胞融合和细胞间传播所必需的。12个BHV-1包膜蛋白(gB,gC,gD,gE,gG,gH,gI,gL,gM和gK)中有10个是糖基化的，2个(gN和Us9)是非糖基化的。5种包膜蛋白(gB,gD,gH,gL和gK)是培养细胞生长所必需的，而其余7种包膜蛋白(gC,gE,gG,gI,gM,gN和Us9)则不是培养细胞生长所必需的。所有α-疱疹病毒gC同系物(包括BHV-1)通过与硫酸肝素蛋白聚糖结合，促进病毒颗粒附着在细胞表面。在没有gC的情况下，gB通过与硫酸肝素结合来补充gC的附着功能。继gB和或gC介导的初始附着后，病毒进入的下一步需要gD与细胞受体内连接蛋白1(也称为HveC)的相互作用或HVEM，肿瘤坏死因子家族蛋白的成员。结合素1属于细胞间黏附分子家族，其外结构域包含3个免疫球蛋白样结构域[10]。肿瘤坏死因子家族的某些成员可诱导细胞凋亡，表示gD与HVEM相互作用可诱导某些细胞类型的凋亡。在gD受体结合后，gB和/或gH-gL复合物与细胞膜蛋白相互作用，导致病毒包膜与细胞膜融合。除了gD受体结合必须发生在融合过程之前，病毒和细胞膜融合的其他机制还没有很好地了解。病毒进入相邻细胞(细胞间传播)也需要gD，因为删除gD基因的病毒不能在细胞间传播。在表达gD的稳定转化细胞中，野生型病毒的细胞间传播受到限制，这表明gD与假定的细胞受体结合，这些受体存在于细胞表面的顶端细胞膜和位于细胞间连接处的外侧细胞膜上。虽然gD是病毒进入细胞的必要糖蛋白，但gH在氨基酸残基450处的代偿性突变(甘氨酸向色氨酸的突变)介导了gD的独立于gD的进入和细胞间的传播。gE和gI之间相互作用也促进细胞间病毒的传播，而gE和或gI缺失突变体在细胞间传播中存在缺陷。gE缺失病毒通过三叉神经节(TG)的从鼻子和眼睛逆向运输，它们在其中的感觉神经元中建立潜伏期[11]。gE缺失病毒不能从潜伏期重新激活，因为它们不能从TG的感觉神经元向鼻或眼腔的非神经元细胞顺向传播[11]。包膜蛋白(Us9)对顺行性神经元传播也很重要，因为在地塞米松诱导的活化后，潜伏感染Us9缺失病毒不会在鼻子和眼睛中传播病毒。另外，Us9缺失的BHV-1和伪狂犬病病毒(PRV)在培养中感染上皮细胞后没有表型。PRV，Us9缺失病毒具有缺陷的顺行神经元传播表型，因为在Us9缺失的情况下，病毒糖蛋白或含有病毒糖蛋白的囊泡的轴突转运不会发生。因此，Us9功能是神经元特异性的，只有在顺行神经元转运的情况下才需要。

BHV-1 gG是蛋白水解后分泌的。此外，gG存在于病毒包膜上，并与受感染的细胞膜有关。与其他a-疱疹病毒gG同源物一样，BHV-1 gG具有趋化因子结合活性，因为它阻断趋化因子与细胞受体和糖胺聚糖(GAGS)的相互作用。由于在膜上gG与各种趋化因子结合，gG的趋化因子结合活性也发生在细胞膜上。由于突变病毒的免疫原性更强，编码gG的BHV-1基因的缺失导致犊牛病毒的衰减[12]。BHV-1 gG编码的趋化因子结合活性是小牛感染后表型减弱的原因。研究表明，许多病毒基因是启动生产性感染和细胞间传播的必要条件。

4 BHV-1的再活化周期

4.1 急性感染导致高水平的病毒产生BRDC并不总是与急性BHV-1感染相关。一般认为，BHV-1从潜伏感染中重新激活的能力可以启动BRDC。急性BHV-1感染是在高水平的程序性细胞死亡的黏膜表面和残留上引起的受纳细胞感染。BHV-1也会导致细胞快速死亡，部分原因是凋亡。病毒基因表达受3个不同阶段的调控:极早期(IE)、早期(E)或晚期(L)。IE基因的表达是由一种病毒粒子组分(α-TIF)控制的。存在两个IE转录单元:IE转录单元IEtul和IEtu2。IEtul编码2种HSV-1 IE蛋白ICP0和ICP4的功能同源蛋白。IEtu2编码的蛋白与HSV IE蛋白ICP22相似[13]。一般来说，IE蛋白激活E基因表达，然后病毒DNA复制发生。L基因表达也被bICP0激活，最终在病毒粒子组装和释放中达到顶峰。如上所述，bICP0对生产感染很重要，因为它转录激活所有病毒启动子，并在感染过程中高表达[14]。急性感染导致高水平的病毒生产和分泌在眼睛，口腔或鼻腔。如果在生殖道开始急性感染，则很容易在生殖道组织中发现病毒脱落。无论感染的部位如何，病毒的脱落可在感染后持续7～10 d。

病毒颗粒，或者亚病毒颗粒，通过细胞-细胞扩散进入周围神经系统。如果感染是通过口腔、鼻腔或眼孔开始的，潜伏的主要部位是TG内的感觉神经元[15]。病毒基因表达水平较高或感染性病毒可在感染后1～6 d的TG中检测到。病毒基因表达和检测的传染性病毒随后被消灭，但病毒基因组可以检测在TG(建立潜伏期)。与培养细胞的生产性感染相比，大量受感染的神经元存活下来，这些神经元含有潜伏的基因组。潜伏期的一个特征是由潜伏期相关基因(LR)产生的大量转录水平和ORF-E这表明LR转录是第一个在受感染神经元中表达的病毒转录，因为我们在犊牛感染24 h后在TG中检测到拼接的LR转录。相比之下，我们不能同时使用RT-PCR检测IE或E基因表达，这表明LR基因产物在编程感觉神经元病毒感染的结果中起着关键作用[16]。支持这一预测的是LR基因产物通过抑制凋亡促进潜伏期的建立和病毒基因表达。ORF-E可诱导小鼠神经母细胞瘤细胞的神经元样生长[17]，从而促进潜伏期的有效建立[18]。因此，ORF-E可促进感染成熟神经元功能的恢复。由于LR基因和ORF-E在潜伏期的维持过程中大量表达，预测它们在潜伏期的维持中发挥积极作用。

皮质类固醇水平升高(压力)和/或免疫抑制可以从潜伏期开始重新激活。牛的运输所带来的压力是一种明显的刺激，它可以触发潜伏期和BRDC的再激活。在从延迟重新激活期间，会产生3种情况：在感觉神经元中容易检测到生产性病毒基因表达;ORF-E和LR基因表达显著下降;感染性病毒由鼻或眼分泌。对潜伏感染BHV-1的小牛或家兔给予地塞米松可重复地激活病毒基因表达并从潜伏期重新激活。虽然许多潜伏感染的神经元表面上不产生感染病毒，但在感染病毒的环境中检测到的神经元病毒基因表达发生的数量要高得多，表明产生病毒的神经元并不常见。

4.2 BoHV-1在牛的非神经位点持续潜伏性存在虽然神经节神经元潜伏性的建立是BHV-1和其他α-疱疹病毒亚科成员潜伏性的主要部位，但潜伏性或持续性感染也发生在非神经部位，例如扁桃体和淋巴结。即使没有发现感染病毒，BHV-1 DNA始终可以在扁桃体，外周血细胞，淋巴结和脾脏潜伏感染小牛检测出。与感觉神经元的潜伏期相比，LR-RNA在潜伏感染的淋巴组织中没有大量表达。当从潜伏感染的犊牛扁桃体的生发中心进行移植时，可以检测到传染性病毒，这为BHV-1已经在淋巴细胞中建立了潜伏或持续感染的假设提供了支持。

4.3 LR基因在潜伏期大量表达，是潜伏期再激活周期所必需的如上所述，LR-RNA在潜伏感染的神经元中大量转录与bICP0基因是相反的。LR-RNA的裂解起始位点位于TG所用起始位点的下游。LR基因有2个ORF(ORF-1和ORF-2)，以及2个缺少初始ATG(RF-B和RF-C)的阅读框。针对ORF-2的肽抗体可以识别LR基因编码的蛋白质。部分LR-RNA被聚腺苷酸化，并在TG中选择性剪接，表明表达了不止1个LR蛋白。LR基因产物抑制细胞增殖，抑制bICP0 RNA表达和凋亡。LR蛋白的表达对于抑制细胞凋亡是必要的，而对于细胞生长或bICP0的表达必需的。

4.4 ORF-E编码一种在潜伏感染小牛的TG中表达的蛋白质存在于LR启动子内的小ORF被指定为OW-E。OW-E是LR转录本和blCP0 ORF下游的反义。包含ORF-E的转录本在被感染的牛细胞和潜伏感染小牛的TG中表达。将ORF-E蛋白编码序列与绿色荧光蛋白(GFIJ)序列融合，在小鼠或人神经母细胞瘤细胞的细胞核中检测到GFP蛋白的表达。相反，ORF-E-GFP融合蛋白在兔上皮细胞中表达。

针对ORF-E肽或整个ORF-E蛋白的多克隆抗血清特异性地识别了转染ORF-E表达质粒的潜伏感染小牛和小鼠神经母细胞瘤细胞TG中感觉神经元的细胞核[18]，ORF-E还在这些小鼠神经母细胞瘤细胞中诱导神经元样突起。相比之下，用空载体转染小鼠神经母细胞瘤细胞后，神经元样突起没有发生变化，这表明ORF-E诱导了神经元细胞的生理变化。构建不表达ORF-E蛋白的BHV-1突变体来检测ORF-E是否在延迟活化周期中起作用是很有必要的。

4.5 急性感染后对BHV-1的免疫反应虽然BHV-1有可能抑制牛的免疫，但最终会产生有效的免疫反应，从而防止全身感染。关于BRDC，这意味着BHV-1启动的免疫抑制是短暂的。

宿主对BHV-1感染的免疫反应包括先 d免疫反应和适应性免疫反应。 先 d免疫反应包括干扰素的抗病毒作用、补体途径的选择以及淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或自然杀伤细胞(NK)的局部浸润。在BHV-1感染后，IFN-α和IFN-P在感染后5 h就可在鼻腔分泌物中检测到，在感染后72～96 h达到最高水平，并可在感染后持续8 d。在感染初期，IFN-α和IFN-P促进白细胞迁移，激活巨噬细胞，增加NK细胞活性。巨噬细胞的活化和NK细胞活性的增加刺激细胞对病毒感染细胞的溶细胞活性。NK细胞是一种缺乏T细胞和B细胞标记物的非贴壁效应细胞。这些细胞需要与目标细胞长时间作用，以达到最佳的裂解效果。此外，NK样细胞毒性也与CD3+CD45+群有关，Fc受体阳性淋巴细胞可能代表γδT细胞的1个亚群。适应性或体液免疫反应导致产生中和抗体，这种抗体结合病毒颗粒并抑制生产性感染。包膜糖蛋白gB,gC,gD和gH是病毒中和抗体最有效的诱导剂。此外，非中和抗体可能介导包膜病毒或细胞膜上表达病毒蛋白的细胞的破坏，这个过程被称为抗体介导的细胞毒性。针对包膜蛋白产生的中和抗体和非中和抗体也可以通过几种不同的机制抑制病毒感染：抗体和补体介导的病毒包膜和病毒感染细胞的膜攻击复合物(MAC)裂解；抗体介导的细胞毒性，其中IgG与Fc受体阳性细胞(巨噬细胞)相互作用；C3b与IgM结合介导与C3b受体阳性细胞(淋巴细胞、巨噬细胞)结合。在所有病例中，病毒感染的细胞都被裂解。感染后8～12 d可检测到病毒中和抗体和非中和抗体(IgG)的产生。局部/黏膜免疫依赖于分泌的中和抗体(IgA分子)，全身体液免疫依赖于IgG。

细胞介导免疫(CMI)反应在杀死细胞表面表达病毒抗原的病毒感染细胞中起着重要作用[19]，例如，CD8+CTL反应是对BHV-1的重要防御，因为上呼吸道上皮细胞间传播发生在血行传播之前[19]。细胞毒性和增殖T淋巴细胞反应发生在感染后8 d左右的血液中。gB和gD DNA疫苗已诱导小鼠CTL反应。此外，gC和gD已被确定为牛CTL应答的靶点，gB DNA疫苗在牛中诱导CTL应答。其他结构和非结构病毒蛋白也可能在CMI反应中发挥作用，因为只有有限数量的BHV-1蛋白被评估为CTL活性。除了破坏感染的细胞外，T淋巴细胞还释放出许多淋巴因子，这些因子具有特异性和非特异性免疫反应。例如，IFN-γ等因子进一步激活巨噬细胞。BHV-1蛋白(gB-,gC-,gD-和VP8[20])是免疫牛的CD4+T辅助细胞。细胞膜上表达gB,gC或gD的细胞也被确定为CD4+T细胞的靶细胞。通常，CD4+T细胞对抗体反应的发生和CD8+T细胞的有效记忆起着重要作用。因此，CD4+T和CD8+T细胞以及抗体都需要长期的保护。

4.6 潜伏期外周神经系统出现较长时间的CMI反应研究表明，T细胞，特别是CD8+T淋巴细胞，在潜伏期控制感觉神经节的HSV-1感染[21]。病毒抗原阳性的神经元被TNF-a,IL-2,IL-6,IL-10或IFN-γ的非神经细胞包围，在潜伏感染HSV-1的小鼠中也可检测到。未感染的小鼠TG中未检测到淋巴细胞形态的细胞。在潜伏感染HSV-2的小鼠或豚鼠的感觉神经节和脊髓中也可检测到淋巴细胞的持续浸润。犊牛感染BHV-1后，急性感染时容易发现浸润淋巴细胞灶。最后，在潜伏感染HSV-1的TC中，也观察到慢性免疫反应[19]。总之，T细胞在潜伏期长期存在于感觉神经节具有调节潜伏期-再活化周期的潜力。

免疫细胞在TC中的持续存在可能是由于病毒蛋白在罕见的神经元或卫星细胞中的表达。在潜伏感染BHV-1的犊牛TG中，可以检测到表达病毒转录和蛋白的罕见细胞，提示分子自发活化发生在BHV-1潜伏期。

产生IFN-γ的CD8+T细胞被认为在阻止潜伏感染HSV-1的小鼠感觉神经元的潜伏性活化方面发挥了重要作用。2项独立研究也得出结论，IFN-α和IFN-γ控制复发性疱疹性病变[22]。除了IFN外，淋巴细胞介导的细胞毒性还可以抑制病毒在TG中的传播。颗粒胞吐是淋巴细胞介导的细胞毒性诱导两种有效的凋亡途径之一。颗粒胞吐途径主要被CD8+，NK和淋巴因子激活的杀伤细胞所利用。表明BHV-1 LR基因在急性感染LR突变病毒的犊牛TG中，淋巴细胞浸润增强，从而发挥调节淋巴细胞浸润的作用[18]。地塞米松诱导潜伏性BHV-1感染小牛TG炎症细胞凋亡的能力与潜伏性再活化有关[13]。

综上所述，BHV-1病原体的特殊性在于编码了抑制免疫系统的特定蛋白，不仅引起了免疫抑制，而且激发和诱导潜伏期感染，这对于本病的消灭带来了极大的难度，所以根据3种晚期蛋白质(gG，UL49.5和VP8)等来设计预防BHV-1的疫苗是很好的思路和方向。