食品欺诈检测中分子生物学技术的应用进展

2020-04-18顾春华刘煜王建军孙霞李中华

食品工业 2020年8期

顾春华，刘煜，王建军，孙霞，李中华

甘肃省食品检验研究院（兰州 730030）

食品安全是全球瞩目的问题，但近几年食品欺诈却越来越活跃于大众视野。食品安全主要关注食品的食源性疾病和食品污染，大多时候并不是刻意掺假。在中国，经过政府的大力治理，食品安全问题得到极大改善，根据国家市场监督总局每年食品的检测数据发现，真正的食品安全问题并不是特别多，而对消费者真正产生信任危机的却是食品欺诈。食品欺诈被称为有明确经济动机的掺假，是以经济利益为目的的食品造假行为，包括在食品、食品成分或食品包装中蓄意使用非真实性物质、替代品、添加物及去除真实成分，或进行篡改、虚报及做出虚假或误导性的食品声明等[1-2]，掺假者是在消费者不知情的情况下，为得到更大经济利益在食品中进行欺骗性的添加、减少或使用非传统的物质代替食品。虽然有些食品欺诈事件并没有引起人身健康安全，但对消费者的信心打击较重，对行业产业的健康发展破坏较大。此外，还存在将养殖三文鱼作为野生三文鱼售卖，将希腊橄榄油标示为意大利橄榄油，将合成香料标为天然香料等标签标示与产品真实性不符的问题。随着食品供应链复杂性越来越大，总体来讲，野生或养殖、地理来源、生物物种方面的商业欺诈较多，比如对于占据水产市场份额较高的鱼糜制品、半加工制品、听装制品的物种真实性较难识别问题[3]。因此，有效鉴别方法对生产者、消费者，甚至于动物保护都是很有必要的。基于此，本文在食品欺诈检测中对分子生物学技术发挥的作用、应用状况、技术局限等进行阐述。

自20世纪80年代以来，最初在食品领域发展起来的是酶分子和免疫鉴别技术，如等电聚焦电泳和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，试验的靶分子是蛋白质，前者利用蛋白质等电点不同的原理，后者利用蛋白质的特异性抗原抗体属性，但这些方法逐渐被淘汰，因为食物经过冷却、腌制、加热等一系列加工后，其标志蛋白的结构发生变化，导致这些方法呈现出低特异性和低适应性。由此催生基于脱氧核糖核酸（DNA）分析的技术方法得到快速发展。DNA分析是在基因水平上对遗传变异的直接反映，可以对不同发育阶段的个体、不同的组织做检测，既不受环境的影响，也不受基因是否表达的限制，而且基因组变异十分丰富，不仅能选择表型性状，也能选择隐性性状。Bostein于1980年提出分子标记技术限制性片段长度多态性（RFLP），为遗传图谱的构建带来革命性变革，随着聚合酶链反应（PCR）技术的产生，相关鉴别技术迅猛发展，对使用频率较高、前沿的PCR技术、分子标记技术、芯片技术等进行介绍。

1 PCR检测技术

PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，是在DNA聚合酶的催化下，使用2段寡核苷酸作为引物，扩增位于2段已知序列之间的DNA区段。PCR技术简单、快速、灵敏，可以同时鉴别多个物种，尤其是可以鉴别经过高压、加热及听装的食物，这些食物中的蛋白质虽遭到变性，但其DNA仍然可检，因此成为实验室的常规检测方法。在进行PCR反应前，目标基因的选择，高效的DNA提取方法是需要考虑的因素。在欧洲疯牛病危机爆发时，设计自线粒体16s核糖体核糖核酸（rRNA）的动物通用引物被广泛用于动物源性的检测[4]，最常见的线粒体靶向基因是细胞色素b（cytb）、12S rRNA、线粒体DNA D-环区基因、缬氨酰tRNA（tRNA）基因，线粒体脱氢酶亚基5基因（ND5），腺苷三磷酸酶（ATPase6/ATPase），以及广泛使用的核能基因18S rRNA，短分散元件序列（SINE），长分散元件序列（LINE）等。另外，提取DNA时，某些食物可能含有抑制PCR的物质，如糖类、全脂牛奶蛋白、胶原蛋白、美拉德反应产物等，所以DNA的提取方式要能去除这些抑制物，必要时添加某些物质，如牛血清白蛋白于体系[5]，有助于PCR反应。

1.1 多重PCR

多重PCR是在一个反应容器里同时扩增多个DNA靶点，与传统的单一PCR系统相比，节省成本和时间，是一种很有发展前景的PCR技术[6]。它的成功依赖于多组引物在同样的样品量、同样的循环条件下，向着各自的目标靶点退火的选择性能力。它要求多对引物要设计合理，反应条件最优化，引物间不能形成二级结构。Matsunaga等[7]首次通过用多重PCR方法检测物种，在同一体系中对山羊、牛、羊、猪、马的线粒体细胞色素b基因进行PCR，成功获得鉴别。对加工的肉类，Di Pinto等[8]和Dhovvati等[9]用多重PCR均进行了方法验证，结果较好。Yin等[10]在2009年用多重PCR鉴别牦牛肉和牛肉，DNA检测限仅0.5 ng，灵敏度非常高。

1.2 实时荧光PCR（qPCR）

实时荧光PCR与通过凝胶电泳获得定性结果的常规PCR相比属于第二代PCR。它是在反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，并利用起始模板浓度的对数与阈值循环数呈反比的原理绘制标准曲线，最终实现对初始模板进行定量。按荧光产生的原理不同分为染料法和探针法。染料法即利用SYBR绿色染料分子产生的荧光信号来进行样品定量，试验成本较低，信号强度好，使用方便，缺点是染料与DNA的结合只具有结构特异性，不具有序列特异性，非特异性扩增会影响试验结果，而且不能用于多重PCR。探针法是在反应体系中除上下游引物外，再增加一条特异性探针，其扩增曲线反应的就是特异性产物的扩增曲线，与染料法相比提高了试验的特异性。市场上的探针主要有TaqMan、分子信标等，商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术。Soares等[11]建立一种基于SYBR绿色染料的实时定量方法去检测肉制品中的猪肉，将已知含量的猪肉混合到禽肉中，获得一个从0.1%到25%的标准曲线，并且通过熔融曲线分析有较高的特异性，经过盲样验证，证明该方法定量检测猪肉可行性较好。Zhang等[12]应用实时定量PCR方法可以在鲜肉、加工肉类、牛奶、奶酪中将牛DNA鉴别并定量。设计一对牛的线粒体cytb基因特异引物，以及FAM标记的哺乳动物特异的cytb基因探针制作出标准曲线，定量检测牛DNA最低至35 pg，并且与绵羊、山羊、猪的DNA无交叉反应。Chen等[13]建立了一种快速鉴别石斑鱼的实时PCR方法。根据线粒体细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（COⅠ）基因序列设计引物和探针，对4个属的10种石斑鱼COⅠ基因序列进行扩增，均观察到129 bp的结果，对其他30种鱼类进行比较，未能扩增到，表明该方法特异性强，能对石斑鱼进行有效鉴别。

1.3 数字PCR

数字PCR是第三代PCR技术[14]，沿袭qPCR荧光化学原理，但对靶标核酸的定量却采用了完全不同的数学原理和技术方法。它不再依赖循环阈值（Ct值）或内参标准，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。它是将一个PCR反应体系分配到大量微小的反应单元中，在每个微反应器中包含或不包含待测核酸靶分子，经PCR扩增后，逐个对每个微反应器进行检测，有荧光信号的判读为1，没有荧光信号的判读为0，根据泊松分布原理及阳性的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现了DNA分子的绝对定量[15-16]。Floren等[17]结合实时定量PCR建立针对核基因F2的两步微滴数字PCR技术，用于对加工肉制品中牛、马和猪的精确定量，其定量限和检测限分别达到0.01%和0.001%。杨硕等[18]为定量鉴别核桃乳中掺杂大豆源，采用多重数字PCR技术，测算出单位质量下核桃和大豆的目的基因拷贝数比值，建立基因拷贝数与质量之间的关系，进而利用该比例关系换算出植物蛋白饮料中核桃和大豆的投料量，实现植物蛋白饮料中植物源性成分的定量检测。但数字PCR的样品通量低，且试验成本较高，推广和应用还期待技术突破。

2 分子标记技术

分子标记技术是通过遗传图谱，指纹识别来识别个体，它不仅能区分掺假的物种，也能区分亚种。在食品检测中，得到广泛运用的分子标记技术是限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、扩增酶切片段多态性（AFLP）、简单重复序列（SSR）等。

2.1 RFLP

R F L P 是用限制性内切酶处理不同的生物体DNA，产生不同长度的分子片段，这种限制性片段长度的差异就是RFLP。之所以有限制性片段长度的多态性，是因为生物体在长期进化过程中，种属间甚至品种间同源DNA序列上限制性内切酶的识别位点不同，或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上核苷酸的插入和缺失造成的。在检测亲缘关系较近的食品掺假方面有较高的准确性。Wang等[19]提出一种PCR-RFLP方法用于阿胶原料的鉴别，从马、牛、驴的干燥皮肤中提取DNA，在细胞色素b保守区分离到359 bp的片段，将这个片段用2个限制性内切酶酶切，获得DNA指纹，据称准确率可达100%。刘金华等[20]通过对绿豆RFLP分子标记图中特异片段序列扩增，成功获得470 bp大小的片段，并与大豆、豇豆等其他豆类做验证，证明该引物具有较强的特异性。但RFLP很容易受到个体突变的影响，如果突变发生在限制位点，就会产生错误的限制图谱。另外，在深加工食品的检测中，因为DNA片段很短，很难找到限制位点，限制性内切酶不完全消化时，就会出现假阴性。

2.2 RAPD

RAPD是利用寡核苷酸随机引物，对基因组进行PCR扩增，与RFLP一样，均以检出DNA多态性为目的，但其检出的不是限制性内切酶片段的多态性，而是随机扩增DNA片段的多态性。RAPD不需要杂交、同位素标记等复杂程序，只需要合成一套随机引物，便可以用于任何物种，是一种快速、简便的遗传标记方法。徐颖等[21]用50个随机引物对泰国香米和非茉莉香米进行扩增，其中22个引物扩增出多态性，并通过S1-1110和S15-450这2个条带的隐性特征来区分泰国香米和非茉莉香米。Saez等[22]建立一种RAPD方法，产生的特异性指纹图谱可以区分猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和火鸡，每个物种有75%相似性和25%物种多态性。RAPD虽然简便快捷，但它的稳定性和重现性都低于RFLP，引物的长度和数量也不统一，导致不同实验室间数据没有可比性。

2.3 AFLP

AFLP是由RAPD和RFLP合成发展而来，它是用2个限制性内切酶对基因组DNA进行酶切消化，将酶切片段用人工接头连接，用特别设计的引物对片段进行选择性扩增，从而揭示DNA的多态性。AFLP具有RFLP的可靠性和可重复性，也有RAPD高效、方便的特点，还具有多态分辨率高，仅需少量DNA模板的优势，因此常用于分析亲缘关系较近的不同品种的食物造假。如鄢绯寰等[23]用AFLP分析8种家鸭和2种野鸭的基因组DNA，通过计算遗传距离和相似性系数将不同品种得以区分。高军等[24]实现对21个中国地方猪、19个欧美商业猪、5个亚欧美野猪等47个猪群的AFLP检测，用22种引物组合产生了312个AFLP多态标记，并计算出47个类群间的遗传相似系数。王晓英等[25]用AFLP技术对4个元帅系苹果品种进行遗传分析，总共12对引物扩增出了多态性条带595条，多态率达72%，建立了苹果的AFLP标记技术体系。AFLP技术的缺点是成本高，对DNA的纯度和酶的质量要求较高，对实验者的操作技能也要求较高。

2.4 SSR

SSR也称为微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列。在每个微卫星两端是相对保守的特异单拷贝序列，因此可根据两端的序列，设计一对特异引物。微卫星中重复单位的数目是高度变异的，其序列也可能完全不同，因此微卫星显示高度的长度多态性。杨航宇等[26]利用SSR技术，用6对引物对43份葡萄品种进行分析，扩增出64个多态性位点，可以区分酿酒品种、鲜食品种，并能区分欧亚种和欧美种。但是SSR必须针对每个染色体座位的微卫星，找出两端的单拷贝序列来设计引物，这给微卫星标记的应用带来困难。

3 基因芯片

基因芯片是利用杂交测序的原理，把寡核苷酸探针或DNA，cDNA采用类似大规模集成电路的手段有规律地排列固定在硅片上，与样品进行反应后，通过扫描获得有关生物信息。从样品制备、杂交反应到信号检测，整个过程集成化，获得微型全分析。它可以检测DNA序列中单个碱基的改变，可进行基因多态性分析，这种多态性比RFLP、微卫星标记等覆盖密度更大，数目也更多，即单核苷酸多态性标记（SNPs）。通常，芯片采用等长位移设计法，按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补核苷酸序列形成探针组合，某一碱基分别用其他三种碱基替换，形成3种不同的单碱基变化的核苷酸探针，可对这段核苷酸序列所有可能的SNP位点进行扫描，实现点突变的检测。石丰运[27]建立一种PCR结合基因芯片鉴别16种动物源性的方法，该方法快速、准确、特异性好，灵敏度可达10 pg，用于对牛、山羊、绵羊、水牛、鹿、驴、猪、狗、兔、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、鸵鸟、鱼等的检测。但是基因芯片合成设备昂贵，成本较高，样品制备复杂，而且杂交在固相上进行，空间因素也对杂交造成不利影响。

4 讨论和展望

食品欺诈是食品风险的一种，是世界范围内各国监管的重点。每年由于食品欺诈造成的损失十分巨大。产地、物种、品种等的虚假声称最为普遍。就肉类产品的标签与实际不符的情况，美国19.4%[28]、耳其22%[29]、瑞士15%[30]、英国8%[30]。中国在2013年破获多起将鼠肉、狐狸肉、水貂肉加工后当作羊肉售卖的犯罪行为。在土耳其，某香肠标签上标示含有5%牛肉，实际并没有发现牛肉DNA，标示100%牛肉的牛肉丸，却发现含有鸡肉和火鸡[31]。鉴别方法的发展也是经过最初的基于形态的味、色、形[32]，到后来的显微镜观察[33-35]，以及显微镜不能确定物种起源而被生物技术所代替，这是技术发展的必然趋势。但是随着食品工业的快速发展，食品形态越来越丰富，不法分子的造假手段也不尽相同，所述的分子生物学技术也各有优缺点，甚至还普遍存在不能有效识别异构体的问题，因此有必要联合其他技术方法包括理化方法，为食品欺诈的检测提供更多的思路。

在选择DNA靶标时，线粒体基因组因为比核基因组具有更多优点，所以常常被选为分子检测的标的。尤其是线粒体DNA在细胞中以多拷贝形式存在，即便是少量DNA，被检测到的可能性也很大。而且，有些加工食物会受到热处理，如烹调、巴氏杀菌、高温灭菌等，或高压、pH调节、辐射、干燥等，对这些高度退化的食物，更适用于线粒体基因，因为可以达到高灵敏度的要求。但是，用线粒体基因组作为物种特异性量化的标的则存在问题。因为不同物种的不同细胞，同一物种的不同个体，同一个体的不同组织，其线粒体基因的拷贝数都是不同的。为解决这个问题，Walker等[36]用基因组DNA的重复序列，短分散元件SINE量化了来自食物中的牛、猪、鸡。

另外，对于分子生物技术的高灵敏性带来的其他问题也应引起重视。如在一个既加工由纯水牛乳制的奶酪又加工普通奶酪的工厂去检测由纯水牛乳制的奶酪是否掺了普通牛乳成分，会产生交叉污染[37]。在这种情况下很难区分是污染还是故意掺假。因此，加工不同物种的食品用不同的生产线是必要的，尤其是原产地保护产品。