冻精制作工艺流程

方焱秋，汪雪烨，顾达夫

长春新牧科技有限公司，吉林长春 130000

1 稀释液的配制

1.1 自配稀释液：第一液：蒸馏水100 mL、柠檬酸钠2.97 g，卵黄10 mL。第二液：取配好的第一液41.75 mL，加入果糖2.5 g，甘油7 mL。配置好的稀释液，每100 mL加青霉素5～10万U，链霉素5～10万U。

1.2 进口稀释液根据稀释液说明进行配制。

2 器械的清洗和消毒

玻璃器皿使用前(或新购置的)，用自来水浸泡洗涤时先在加有洗涤剂的温热溶液中进行刷试，然后用流水反复冲洗3次以上，直到干净为止，最后用蒸馏水冲洗，直至器皿光亮，无水滴附着。

将清洗干净的玻璃器皿放入鼓风干燥箱，温度设置为160 ℃，干燥箱达到160 ℃后恒温2 h，自然冷却后待用。

检查精液的载玻片和盖玻片，用水冲洗干净后，浸泡于75%酒精后，用柔软的布擦试干净备用。

塑料细管、指拇管、吸头、纱布袋、胶塞、细管用冷冻架紫外线消毒30 min后方可使用。

3 采精前的准备

3.1 各种仪器预热调试，达到所需温度和最佳状态。

3.2 凡是接触精液的器械均应放在33～35 ℃恒温箱中，配置好的稀释液应放在32～34 ℃恒温水浴锅中备用。

4 采集精液的处理

4.1 外观检查

主要是观察精液有无异常现象：如血精、脓精、异物等，不正常精液弃掉。

4.2 精液量

分为测量法和称量法两种。

4.2.1 测量法：集精杯先通过仪器校对后，直接读取毫升刻度数。

4.2.2 称量法：通过称重确定精液的量，按照精液的比重（1.04）换算成毫升。本方法是对精液的总量通过称重确定，比目测集精管刻度确定精液的总量更为精确。

4.3 密度测定

通过专用窗口将采集的精液传递入精液处理室后，使用密度仪来检测精液的密度值。

4.4 镜检活力

用移液器取精液中段一小滴精液置于载玻片上，加上盖玻片，将载玻片放置在38 ℃恒温装置的相差显微镜上，通过电视荧光屏放大500倍的图像来判定活力，镜检合格者方可进行下一步的稀释。

4.5 记录

及时记录牛号、采精量、精子密度、精子活力、可制作细管数和所加稀释量等有关数据。

5 稀释

根据原精量、密度、活力、预测冻后活力等，确定稀释液加入量。稀释方法：用量筒先取精液的三倍稀释液，等温、沿集精杯壁倾斜，缓慢冲洗至少3次，至稀释瓶中，降温20 min后，再加入剩余稀释液量，缓慢轻轻摇匀后，送至封装机封装。

6 封装

将稀释好的精液放在20 ℃实验室操作台上用喷墨打印一体机进行细管分装操作。该设备自动化程度高，并且对细管精液的卫生质量保证极为有利。

7 平衡

将分装好的细管精液放置于不透光的塑料盒内，然后把塑料盒放入4 ℃低温平衡柜中平衡3～4 h。并在平衡柜边沿盖上毛巾，避免强光进入低温平衡柜内。

8 精液冷冻

8.1 上架：将平衡后的细管精液，上架码放，同时进行计数。码放时注意细管摆放的方向一致，棉塞封口端靠近操作者，便于装入指拇管。

8.2 冷冻：将冷冻机调至-120 ℃，将风扇转速调至70，待冷冻机温度降至-120 ℃时，持续5 min，风扇转速调至30后，把以排满待冻细管的架子，迅速放入冷冻机内盖严盖子，将风扇转速调至70，温度达到-120 ℃时，冷冻8 min。

9 解冻

把水浴锅加热至38 ℃稳定后，将冷冻后的细管精液迅速浸泡入38 ℃水中并晃动，待完全解冻后立即取出，用纱布或吸水纸擦干水珠，进行显微镜下检测，活力判定在35%以上保留。

10 分装

按包装要求，每袋100支，填写纱布袋标签信息，快速包装，包装好的细管精液放入液氮罐中储存，设专人保管，每周定时加氮。

11 整理计录

生产结束后，按品种、牛号、生产量整理好原始记录，填写生产记录上报，原始记录存档。

12 出库

将一周生产的冻精，通过质量、数量检查，与销售人员通过核对后，办理交接手续。

（注：生产技术规程按GB 4143-2008 NY/T 1234-2006 GB/ T 30396-2013执行）