大黄素对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞上皮间质转分化及Mfn2表达的影响

2020-04-15龙脉李梦婕柯本黄金菁房向东

天津医药 2020年3期

龙脉，李梦婕，柯本，黄金菁，房向东

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患病率逐年上升，已成为全球公共卫生与健康问题［1］。肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各种不同病因CKD 进行性发展至终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的共同病理状态，其特征性病变为肾小管萎缩、大量炎性细胞浸润、肌成纤维细胞活化，导致细胞外基质成分过度堆积，最终取代正常肾脏结构，造成肾脏功能不全与丧失［2］。大黄素（emodin，EM）是中药大黄的有效活性成分，属于蒽醌类物质，具有抑菌、抗炎、调节免疫、抗肿瘤、保肝利胆、利尿、改善肾功能等药理作用［3］。研究认为，大黄素可以改善大鼠肾脏纤维化［4］，但是大黄素长期给药会对小鼠肾脏产生毒性作用［5］。线粒体融合蛋白2（mitofusin2，Mfn2）是线粒体外膜上的跨膜蛋白，主要参与线粒体外膜融合，在线粒体能量代谢、细胞葡萄糖水平、细胞增殖、凋亡、自噬等方面发挥着重要作用［6］。线粒体功能障碍及功能受损参与了糖尿病肾病的发生和发展［7］，Mfn2 过表达下调了胶原蛋白Ⅳ的表达，显示出对糖尿病肾病的保护作用［8］。目前关于Mfn2 在肾脏纤维化中的研究少见。本研究旨在探讨在转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）刺激后人肾小管上皮HK-2 细胞中Mfn2 的表达水平，观察大黄素干预后Mfn2的表达水平变化，探讨大黄素对肾脏纤维化的保护作用机制及其与线粒体功能的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 HK-2细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），DMEM/F12培养基及胎牛血清（以色列BI公司，04-001-1-A），重组人TGF-β1（美国Peprotech公司，100-21），大黄素（Sigma，E7881），CCK-8试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，BA00208），RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）及Western blot 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），兔抗Mfn2单克隆抗体（英国Abacm 公司，ab124773），兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体、兔抗结缔组织生长因子（CTGF）多克隆抗体及兔抗E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号分别为bs-10196R、bs-0743R、bs-1519R），兔抗GAPDH 多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，10494-1-AP），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（博士德生物工程公司，BA1060），CO2培养箱（SANYO，MCO-15AC），倒置显微镜（日本OLYMPUS-CX41），SDS-PAGE微型凝胶电泳及转膜设备（美国BIO-RAD 公司），全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，Tanon-5200），低温高速离心机（德国Sartorius-3k30）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HK-2 细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基培养，加入1%的青霉素和链霉素双抗，于37 ℃，5%CO2条件下进行培养，细胞融合至80%，0.25%胰蛋白酶消化，隔天换液，2～3 d 传代 1 次，取对数生长期HK-2 细胞进行后续实验。

1.2.2 大黄素母液精确称取大黄素10 mg，并用666.67 μL的DMSO超声溶解，得到浓度为50 mmol/L的大黄素母液，使用时DMEM/F12培养基稀释。

1.2.3 CCK-8 法检测大黄素对HK-2 细胞增殖活性的影响在96孔板中接种HK-2细胞悬液（每孔100 μL，约5 000个细胞），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁，融合至50%左右，弃去上清用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，换无血清培养基饥饿。24 h后弃去无血清培养基，向各孔中加入不同浓度（0、10、20、40、80、160 μmol/L）的大黄素溶液，设置空白对照组，每组设5个平行复孔。将培养板于培养箱孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避免产生气泡，放培养箱孵育2 h，用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（A）值。计算：细胞存活率（%）=［A（加药）-A（空白）］/［A（0 加药）-A（空白）］×100%。实验重复3次。

1.2.4 实验分组及干预根据CCK-8实验结果，为避免高浓度EM 干预对HK-2 细胞活性的影响，最终选择浓度为10、20、40 μmol/L 的EM 进行后续实验。因此，实验分空白对照组、TGF-β1 组、TGF-β1+EM（10、20、40 μmol/L）组。培养HK-2 细胞，将细胞接种在6 孔板中，待细胞融合至50%左右，换无血清培养基饥饿24 h，大黄素干预组加入不同浓度EM，30 min 后 TGF-β1 组和各浓度大黄素干预组给予 10 μg/L 的TGF-β1刺激48 h，收集细胞进行Western blot免疫印迹分析。

1.2.5 Western blot法检测Mfn2、α-SMA、CTGF及E-cadherin蛋白表达各组6 孔板中的细胞用预冷的PBS 清洗2 遍，加入RIPA裂解液，刮取细胞提取总蛋白，取上清后采用BCA法进行蛋白定量，余蛋白样品加6×蛋白上样缓冲液，金属浴100 ℃变性6 min。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白（75 V 30 min，110 V 65 min），湿转（200 mA，90 min），5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，孵育一抗，Mfn2（1∶2 000），α-SMA（1∶2 000），CTGF（1∶2 000），E-cadherin（1∶1 000），GAPDH（1∶50 000），4 ℃摇床过夜。次日，洗膜、室温孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（1∶8 000）1 h，洗膜，ECL 显影液曝光，Image J软件进行半定量分析。实验重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2组间均数比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度大黄素对HK-2细胞增殖的影响 0、10、20、40、80、160 μmol/L 的大黄素处理组的HK-2细胞的存活率（%）分别为100.00±0.00、90.89±2.17、88.52±1.67、87.72±2.00、63.46±1.73、52.19±2.60，呈逐渐降低趋势（n=3，F=287.553，P＜0.01）。

2.2 TGF-β1 刺激后HK-2 细胞中上皮间质转分化（EMT）相关蛋白E-cadherin、α-SMA、CTGF 表达的变化与空白对照组相比，TGF-β1 组α-SMA 及CTGF蛋白水平升高，E-cadherin蛋白表达降低（P＜0.05），见表1、图1。

Tab.1 Expression levels of EMT-related proteins after TGF-β1 stimulation in HK-2 cells表1 TGF-β1刺激后HK-2细胞EMT相关蛋白表达水平（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白对照组TGF-β1组t E-cadherin 1.000±0.000 0.706±0.046 11.065＊＊Mfn2 1.000±0.000 1.590±0.134 7.614＊α-SMA 1.000±0.000 1.199±0.077 4.473＊CTGF 1.000±0.000 1.337±0.088 6.665＊

2.3 大黄素对TGF-β1 诱导的HK-2 细胞中E-cadherin、α-SMA、CTGF 蛋白表达的影响与TGF-β1组相比，给予各浓度大黄素干预后，HK-2细胞中α-SMA 及 CTGF 蛋白水平降低，E-cadherin 蛋白表达升高（P＜0.05），且大黄素浓度越高，作用越明显，见表2、图1。

2.4 大黄素对TGF-β1诱导的HK-2细胞中Mfn2蛋白表达的影响与空白对照组相比，TGF-β1 刺激后，HK-2 细胞中Mfn2 蛋白表达增加（P＜0.05），各浓度大黄素干预后，Mfn2蛋白表达水平较单纯给予TGF-β1 刺激时表达减少（P＜0.01），且大黄素浓度越高，抑制作用越明显，见表1、2，图1。

3 讨论

近年来，尽管CKD 治疗取得一定的进展，目前仍无特效药物或其他手段对CKD 患者进行有效根治性治疗，伴随肾间质纤维化的进展，最终发展为终末期肾病［9］。肾间质纤维化是CKD的最常见病理表现，主要特征为成纤维细胞的增殖、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积累以及肾单位功能性丧失［2］。肾小管上皮细胞EMT是活化的肌成纤维细胞的重要来源之一，是RIF的核心环节，主要表现为上皮细胞失去黏附能力、α-SMA表达和肌动蛋白的重组、基底膜破坏、细胞迁移和侵袭能力增强［10］。TGF-β1为公认的促纤维化因子，可刺激肾小管上皮细胞的EMT，促进RIF 的进展［11］。在TGF-β1 诱导后，肾小管上皮细胞发生表型转化，上皮标志蛋白E-cadherin 表达减少，间充质标志蛋白α-SMA 表达增加［12］。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）作为一种促纤维化因子，可通过与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合，调节成纤维细胞ECM 的合成和诱导肾小管上皮细胞的 EMT 产生［13］。Wong 等［14］研究认为，外源性TGF-β1诱导成纤维细胞后CTGF表达水平升高，体内外CTGF的表达依赖TGF-β1信号通路，CTGF 是TGF-β1 的下游信号分子。因此，E-cadherin、α-SMA 和 CTGF 蛋白都是发生 EMT 时的标志蛋白。本实验结果显示，与空白对照组相比，在给予TGF-β1诱导后，Western Blot检测到HK-2细胞中α-SMA和CTGF蛋白表达增多，E-cadherin蛋白表达减少，表明TGF-β1 刺激后HK-2 细胞发生了EMT，提示成功建立了肾小管上皮细胞EMT模型。

大黄素为中药大黄的有效成分之一，在肾脏中有着利尿及改善肾功能的药理作用［3］。越来越多的研究表明，大黄素对肾脏具有保护及治疗作用。Ma等［4］研究认为，大黄素可能通过下调TGF-β1/Smad信号通路改善大鼠肾脏纤维化，显示出大黄素的抗肾脏纤维化作用。Guan等［15］研究发现，大黄素通过抑制TGF-β1 信号传导并随后抑制EMT、成纤维细胞活化和ECM沉积，来减轻博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化。另外，窦芳等［16］研究表明，大黄素通过抑制 Akt/mTOR 通路，改善 TGF-β1 诱导的 HK-2 细胞纤维化相关蛋白的表达，减少细胞损伤，从而延缓肾纤维化进展。本研究结果显示，不同浓度的大黄素均对HK-2 细胞的增殖有抑制作用，但是以80、160 μmol/L 浓度的抑制作用更加明显，考虑到高浓度大黄素对HK-2 细胞的毒性作用，因此以10、20、40 μmol/L 浓度进行后续的实验。结果显示，在HK-2细胞中给予TGF-β1刺激后，发生了EMT，在给予大黄素干预后，α-SMA 和CTGF 蛋白表达减少，E-cadherin蛋白表达增加，表明大黄素明显改善了肾小管上皮细胞EMT，从而显示出其抗肾脏纤维化作用。此外，大黄素浓度越高，抑制作用越明显，显示出剂量依赖性。

Tab.2 Expression levels of E-cadherin,α-SMA,CTGF and Mfn2 in HK-2 cells表2 各组HK-2细胞中E-cadherin、α-SMA、CTGF 、Mfn2蛋白表达水平（n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与TGF-β1对照组比较，b与TGF-β1（10）组比较，c与TGF-β1（20）组比较，P＜0.05

组别TGF-β1组TGF-β1+EM（10）组TGF-β1+EM（20）组TGF-β1+EM（40）组F E-cadherin 0.706±0.046 0.893±0.054a 0.995±0.033ab 1.171±0.075abc 38.520＊＊α-SMA 1.199±0.077 1.021±0.073a 0.905±0.026ab 0.785±0.053abc 25.108＊＊CTGF 1.337±0.088 0.878±0.049a 0.744±0.071ab 0.580±0.064abc 65.947＊＊Mfn2 1.590±0.134 1.252±0.123a 0.766±0.091ab 0.554±0.046abc 60.649＊＊

Mfn2是一种高度保守的跨膜GTP酶类，广泛表达于心、肾、骨骼肌、肝、脑等组织器官，尤以心、肾和脑最为丰富。Mfn2定位于细胞内线粒体外膜，具有促进线粒体融合和维持线粒体正常结构的功能，在高血压、冠心病、内分泌疾病、肿瘤等多种疾病中发挥着关键作用［17］。在糖尿病肾病大鼠模型中，Mfn2的过表达减轻了模型大鼠的肾脏病理改变，抑制了胶原蛋白Ⅳ的合成，改善了氧化应激和线粒体功能，在糖尿病肾病早期起着保护作用［18］。目前，还少见关于Mfn2与肾纤维化方面的进展。本研究中，与空白对照组相比，在给予TGF-β1 诱导后的肾小管上皮细胞中，Mfn2蛋白水平升高，给予大黄素干预后，Mfn2 蛋白水平又随之降低，且大黄素浓度越高，抑制作用越明显，表明在肾小管上皮细胞发生EMT时，Mfn2 表达上调，而大黄素的干预又使Mfn2 表达下降，因此，笔者考虑大黄素可能会通过减少TGF-β 1诱导的Mfn2表达来改善肾脏纤维化。

综上所述，TGF-β1 可以诱导HK-2 细胞发生EMT；大黄素能显著逆转 TGF-β1 诱导的HK-2 细胞转分化作用，保护受损的HK-2细胞，早期阻断这一过程可能预防或延缓肾间质纤维化的发生；Mfn2表达水平在肾小管上皮细胞发生EMT后发生改变，提示Mfn2及线粒体功能与肾脏纤维化的密切联系，其可能是肾脏发生纤维化的早期生物标志物；大黄素能降低EMT后Mfn2的表达水平，可能通过调节线粒体功能来减缓肾脏纤维化，发挥肾脏保护作用。