磁性多壁碳纳米管固相萃取-液质联用法测定植物油中的黄曲霉毒素B1

吴静娜 杨秀娟 韦璐阳 蒋越华 农耀京

摘 要：以化学共沉淀法制备的MWCNTs-Fe3O4为磁性吸附剂，结合高效液相色谱串联质谱测定植物油中的黄曲霉毒素。样品加入正己烷后，用pH=3.0、体积分数为12.5 %的乙腈—水溶液提取，最后加入MWCNTs-Fe3O4进行磁性固相萃取。优化了萃取剂、吸附剂用量、吸附时间、洗脱剂、洗脱时间等磁性固相萃取条件。结果表明，黄曲霉毒素AFB1其线性范围内线性关系良好，相关系数为0.9987，方法检出限为0.01 μg/kg，定量限为0.04 μg/kg。在样品中分别添加水平为5，10 和 20 μg/kg 的AFB1，回收率为81.5 %～104.5 %，相对标准偏差为1.5 %～4.3 %。该方法简便、快速、准确，可用于植物油中黄曲霉毒素AFB1的检测。

关键词：磁性固相萃取 黄曲霉毒素 多壁碳纳米管 高效液相色谱串联质谱

中图分类号：O657               文献标识码：A

Abstract：Aflatoxins in vegetable oil were determined by HPLC tandem mass spectrometry with MWCNTs-Fe3O4 which prepared by chemical co-precipitation as magnetic adsorbent. After adding n-hexane，the samples were extracted by acetonitrile-water solution with a pH of 3.0 and a volume fraction of 12.5%，and purified by MWCNTs-Fe3O4. The magnetic solid phase extraction conditions such as extraction agent，adsorbent dosage，adsorption time，eluent and eluent time were optimized. The results showed that aflatoxin AFB1 had a good linearity with the correlation coefficient of 0.9987. The LOD was 0.01μg/kg and the LOQ was 0.04μg/kg. The average recoveries at spiked levels of 5，10，20 μg/kg ranged from 81.5% to104.5% with relative standard deviations between 1.5% and 4.3%. The method is simple，rapid and accurate for the determination of AFB1 in vegetable oil.

Key words：Magnetic solid phase extraction;aflatoxin;multi-walled carbon nanotubes; HPLC-MS/MS

真菌毒素的污染已经成为食品安全关注的热点。玉米、花生、大米及植物油脂等粮油农产品及其制品在生产、流通、储存过程中由于易污染产生黄曲霉毒素及其代谢物。目前发现的黄曲霉毒素中，毒性最强的是黄曲霉毒素B1（AFB1），被世界卫生组织的癌症研究机构认定为 I 类致癌物[1-2]。随着食品安全管控越来越严格，世界各国对AFTs制定了严格的限量标准[3]，其中日本要求最为严格：所有食品中均不能检出黄曲霉毒素;欧盟对不同类食物中AFB1的限量值为2.0～8.0 μg/kg;我国的限量标准[4]要求谷物及其制品、糧油中AFB1的限量值为5.0～20.0 μg/kg。

黄曲霉毒素的标准检测方法[5]主要为高效液相色谱法[6]、同位素稀释液相色谱—串联质谱法[7-8]和酶联免疫吸附测定法[9]。这些方法各有其优缺点，质谱法尽管灵敏度高，但是往往需要经过繁琐的前处理减少机制干扰;酶联免疫分析耗时短，但抗体价格高、种类少，假阳性检出率高等。植物油中的黄曲霉毒素由于浓度低且基质里含有的油脂、脂肪酸和色素等，会对测定造成严重干扰，降低分析的灵敏度[10]。因此，亟需建立一种同时检测和分离富集黄曲霉毒素的样品前处理方法。

磁性固相萃取（MSPE）技术[11]是一种快速高效的前处理方法。本研究在羧基化多壁碳纳米管的基础上合成MWCNTs-Fe3O4磁性纳米颗粒，利用多壁碳纳米管的π-π相互作用、氢键相互作用等作用力使黄曲霉毒素AFB1从基质中分离和富集。该法具有快速、简便、回收率高等特点，能够满足植物油中AFB1的检测分析，具有一定的实用价值。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

超高压高效液相色谱仪（日本岛津公司）;AB SCIEX-API3200 三重四级杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）;Thermo Helios G4CX电子显微镜（美国Thermo Scientific 公司）;聚焦离子束纳米制备和加工系统（德国CarlZeiss公司）;振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）;真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）;加热磁力搅拌器（德国IKA公司）;多壁碳纳米管（—COOH，20～30 nm，>98%，中国科学院成都有机化学有限公司）;甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二氯甲烷（色谱纯，美国 Thermo Fisher公司）;FeCl3·6H2O，FeCl2·4H2O、NaOH（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;黄曲霉毒素AFB1标准品（青岛普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 WCNTs-Fe3O4的制备

采用共沉淀法制备WCNTs-Fe3O：称取5.2 g FeCl3·6H2O和2.0 g FeCl2·4H2O溶于25 mL除氧水中，加入1.0 mL 12 mol/L HCl加熱溶解，配置成Fe3+溶液备用。于250 mL 1.5 mol/L NaOH溶液加入2.0 g羧基化多壁碳纳米管（WCNTs-COOH），转入三颈烧瓶中，于85 ℃ 水浴（N2保护）加热超声搅拌30 min后，将Fe3+溶液逐滴加入生成MWCNTs-Fe3O4，用强磁铁吸附生成的WCNTs-Fe3O4纳米颗粒，弃去反应液，然后用去离子水清洗直至pH=7.0。最后将此磁性吸附材料于50 ℃真空干燥24 h，备用。

1.3 标准溶液的配制

混合标准曲线的工作配制：分别配制上机浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1标准溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅡ十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（2.0 mm×75 mm×2.2 μm）;柱温：40 ℃;进样体积：5.0 μL;流速：0.30 mL/min;流动相采用不同比例的乙腈和0.1 %甲酸水溶液。梯度洗脱条件：0.01 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）为2∶98;5.00～5.50 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）为75∶25;8.00 min，V（乙腈）∶V（0.1%甲酸）为2∶98。

1.5 质谱条件

质谱条件：电喷雾电压：5500.0 V，离子源温度：550 ℃，气帘气压力55 psi，雾化气压力55 psi，加热气压力55 psi。电喷雾离子源（ESI），采用正离子MRM多反应监测扫描， AFB1母离子及子离子见表1。

1.6 样品前处理

称取植物油5.0 g，加入2.0 mL正已烷，混匀3 min后，再加入10.0 mL pH为3.0体积分数为12.5%乙腈水溶液，涡旋混匀，加入15.0 mg MWCNTs-Fe3O4，低速振荡吸附5 min，用强磁铁吸附磁性吸附剂，弃去上清液。加入1.0 mL乙腈振荡洗脱5 min。洗脱液氮吹近干，用甲醇定容至1.0 mL，HPLC-MS/MS上机检测。

2 结果与讨论

2.1 吸附剂MWCNTs-Fe3O4扫描电镜测试

将1.2所制备的MWCNTs-Fe3O4纳米颗粒经电镜扫描测定如图1所示，由图可知，该磁性纳米颗形状为球形，平均粒径为38 nm。

2.2 磁性固相萃取条件的优化

2.2.1 萃取剂的选择

黄曲霉毒素AFB1属于中等极性化合物，易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等有机溶剂，本实验对比了12.5%甲醇—水、甲醇、12.5%乙腈—水、乙腈作为萃取剂时的萃取效果，萃取效率对回收率的影响见图2。由图可知，12.5%的乙腈-水提取效果最好，可能原因是适量的水能增大萃取剂在样品中的渗透能力，甲醇和乙腈浓度过高时，萃取剂与吸附剂间的竞争加强，造成回收率降低。因此本实验选择12.5%的乙腈—水体系作为萃取剂。

2.2.2 萃取剂pH的影响

AFB1在酸性条件下能稳定存在，因此需要对萃取剂的酸度选择进行优化，以保证萃取效率。本实验将12.5%乙腈—水萃取剂的pH分别调至1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，pH对回收率的影响见图3。结果表明，pH在3.0到5.0时，AFB1的回收率均能达到80%以上， pH 为3.0时回收率最高。pH值继续增大，回收率开始降低，原因可能由于碱性增强使部分AFB1分解造成的。因此，本实验选择萃取剂的pH为3.0。

2.2.3 吸附时间的影响

在pH=3.0的12.5% 乙腈—水作为萃取剂的条件下，考察了吸附时间分别为1，3，5，10，15 min时对AFB1回收率的影响。结果见图4。由图可知，1 min至5min 时，AFB1的回收率随着时间增加而增大，回收率达到85%～95%间，基本达到吸附平衡。5min之后，AFB1的回收率基本不再变化。因此，吸附时间选择为5 min。

2.2.4MWCNTs-Fe3O4吸附剂用量的影响

吸附剂的用量也对萃取效率产生显著影响。本实验分别考察了吸附剂用量为1.0，5.0，15.0，20.0， 30.0 mg时的萃取效果。实验结果见图5，随着吸附用量的增加，AFB1的回收率逐渐增大，直至达到吸附平衡，此时吸附剂用量为15.0 mg。随着吸附剂用量继续增加，AFB1的回收率有下降的趋势，其原因可能是由于吸附剂用量大，容易造成洗脱阶段洗脱不完全。因此，吸附剂用量选择15.0 mg。

2.2.5 洗脱剂的选择

洗脱剂的极性直接影响洗脱效率。本实验选择了5种极性不同的洗脱剂考察洗脱效果，分别为：乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和丙酮。洗脱效果见图6。洗脱效果为乙腈>甲醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>丙酮。主要原因是黄曲霉毒素AFB1为中等极性化合物，洗脱剂极性越大，洗脱能力越强。因此，本实验选择乙腈为洗脱剂。

2.2.6 洗脱时间的影响

适合的洗脱时间不仅能提高回收率，也可以缩短前处理时间。洗脱时间过长，造成回收率下降。实验分别考察了洗脱时间为1，3，5，10，15 min时对AFB1回收率的影响。由图7可知，5 min时，洗脱效果最好，AFB1的回收率最大。继续增加洗脱时间会导致部分已经洗脱的AFB1重新被吸附，造成回收率降低。因此，洗脱时间选择5 min。

3 方法评价

3.1 线性范围

配制浓度分为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的AFB1标准溶液，标准溶液的色谱图见图8。以质谱峰面积为纵坐标，AFB1浓度为横坐标作线性回归，回归方程、线性范围及相关系数见表2，由表中数据可知，AFB1 在0.5～50.0μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.9987。以3倍信噪比（S/N= 3）对应的浓度为方法检出限（ LOD） ，10 倍信噪比（S/N=10）对应的浓度为定量限（ LOQ） ，检出限为0.01 μg/kg，定量限为0.04 μg/kg。

3.2 方法的灵敏度、精密度和准确度

选用食用调和油、花生油和玉米油的空白样品作为基质，分别添加3个不同水平的AFB1，按照1.6方法进行样品前处理，利用HPLC-MS/MS平行测定6次，计算回收率以及相对标准偏差（RSD），具体结果见表3。

3.3 方法验证

随机购买市场销售的食用油样品10份（种类包含食用调和油、玉米油和花生油）进行检测，检出1份花生油样品含AFB1，含量为5.88 μg/kg，低于我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定的花生油中AFB1的限量值20 μg/kg。其余9份样品中AFB1未检出。

4 结论

本文采用共沉淀法制备了磁性固相萃取吸附剂MWCNTs-Fe3O4，建立了磁性固相萃取结合HPLC-MS/MS检测食用植物油中黄曲霉毒素AFB1的检测方法。该前处理方法操作简便，减少了有毒有害有机试剂的使用，同时由于磁性固相萃取的分离和富集作用，降低了油脂样品中脂溶性物质、基质、杂质等干扰因素，使方法的灵敏度和精密度得到提高，能够满足植物油中黄曲霉毒素AFB1的检测要求。

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