传统膏方的长期稳定性试验研究

梁欣健 姜倩娥 孔燕兴 王叶茗▲ 周健文

1.广州市中西医结合医院，广东广州 510801；2.广州市天河区中医医院，广东广州 510665；3.广东在田药业有限公司，广东清远 511517

膏方是中医的一种传统用药剂型，是采用中药饮片加水煎煮，经浓缩收膏等工艺制作而成的稠糊、半流状固体[1]，其应用是在中医药基础理论的指导下，遵循个体化用药、一人一方、辨证论治、随证加减原则，具有滋补强身、抗衰延年、防病治病等多种作用[2]，在临床诊疗及日常养生保健中的应用十分广泛。

目前国内有开展膏方诊疗服务的医疗机构，其患者膏方的制作主要有两种方式：一是由各医疗机构膏方室自行组织安排生产制作，二是委托药厂代为加工制作。因此，各单位制作的中药膏方其质量参差不齐。但目前国内仍然未见关于中医膏方的“国家标准”，仅有中华中医药学会发布的《中医养生保健技术规范——膏方》、以及上海中药行业协会发布的《定制膏方加工管理规范》和《定制膏方加工管理细则》等行业规范，因此全国大部分地区的膏方只能按照《中国药典》（2015年版）四部通则0183项“煎膏剂”的标准执行。

稳定性研究是药品质量控制研究的重要组成部分，它直接影响着药品的质量、临床用药的有效性和安全性[3]，而近年国内学者对膏方质量标准的研究大部分集中于薄层鉴定、含量测定等项目[4-5]进行研究，但对于中医膏方的稳定性如何？一般服用的保质期为多久？按照《中国药典》（2015年版）的微生物限度检查法进行检查是否可行？仍然有待进一步研究和考察。为此，笔者对传统膏方的长期稳定性进行研究，现将有关结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器

Sartorius BS 110S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SH-系列鼓风干燥箱（上杭仪器有限公司）；SW-CJ系列洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；HPX-9162 MBE数显电热培养箱（上海海迅实业有限公司医疗设备厂）；ZRH-150B生化培养箱（广东省医疗器械厂）；LRH-150-M霉菌培养箱（广东省医疗器械厂）；立式压力蒸汽灭菌器 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂 ）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）；SC69-02型水分快速测定仪（上海平平仪器厂）；PYX-DHS-35电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 试药

益母阿胶膏（由广州市中西医结合医院膏方室提供，批号：171101，171102，171103）金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]，枯 草 芽 孢 杆 菌[CMCC（B）63501]，白 色 念 珠 菌[CMCC（B）98001]，黑 曲 霉[CMCC（B）98003]，大 肠 埃 希 菌[CMCC（B）44102]（均购自中国药品生物制品检定研究院），胰酪大豆胨琼脂培养基（20160621），沙氏葡萄糖琼脂培养基（20160224），麦康凯液体培养基（20150820），麦康凯琼脂培养基（20151123），无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（20160316）（均购自青岛海博生物技术有限公司），聚山梨酯-80（20160503，购自湖南尔康制药有限公司）。

1.3 方法

由于传统膏方的制作是采用一人一方的形式，其药物组成并不固定，难以制定一个相对稳定的指标，对其化学成分等进行定性或定量测定，因此在本实验的长期稳定性研究中，以广州市中西医结合医院产科和妇科常用的传统中医特色膏方基本方（处方由益母草、当归、川芎、桃仁、炮姜等组成），采用铜锅煎煮，明火加热的传统制作方法制成的益母阿胶膏作为模型药物，在常规传统膏方的储存条件下（陶瓷容器密封包装、冰箱2～8℃条件下储存），分别考察其在0、1、2、3、6、12个月的水分含量、相对密度及微生物含量。

1.3.1 微生物限度检查方法学验证

1.3.1.1 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌和枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24h，接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25℃培养2～3d，接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25℃培养5～7 d。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯-80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

1.3.1.2 供试液的制备 取供试品10g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作稀释剂至100mL，用匀浆仪混匀，制成1∶10的储备液；再取10mL的储备液，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100mL，摇匀，制成1∶100的供试品溶液。

1.3.1.3 需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法验证（平皿法）

1.3.1.3.1 试验组 取1mL供试液，在供试液中分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液小于100cfu，混匀，加入相应培养基，培养，计数。

1.3.1.3.2 菌液组 取小于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液或白色念珠菌和黑曲霉菌菌液，注皿，培养，计数。

1.3.1.3.3 供试品对照组 取供试液1mL注入平皿，加入相应培养基，培养，计数。

1.3.1.3.4 培养条件 进行需氧菌总数计数方法适用性试验时，使用胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度为32℃，培养时间为3d。

进行霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验时，使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度为22℃，培养时间为5d。

1.3.1.3.5 回收率计算公式 试验组回收率=（ 试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液组菌落数。

1.3.1.4 控制菌检查方法验证 由于益母阿胶膏的药材原料不含动物脏器，因此在控制菌检查中只需要检查大肠埃希菌一项。

1.3.1.4.1 试验组 取1∶10供试液10mL加入到100mL胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，加入80cfu的大肠埃希菌，于35℃培养18～24h后，取预培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，于42～44℃培养24～48h。再取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板中，按照30 ～ 35℃培养18 ～ 72h后检查。

1.3.1.4.2 供试品对照组 除不加试验菌液外，其余按1.3.1.4.1项同法进行检查。

1.3.1.4.3 菌液组 直接取菌液，按2.1.4.1项同法进行检查。

表1 益母阿胶膏的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法验证的平均回收率（%）

表2 益母阿胶膏的控制菌检查方法验证结果

表3 益母阿胶膏的微生物限度检查结果

表4 益母阿胶膏的水分含量及相对密度测定结果

1.3.2 微生物限度检查 取益母阿胶膏三批，按照上述已建立的微生物限度检查方法，分别于第0，1，2，3，6，12月最后一天时取样，按照《中国药典》（2015年版）四部通则的1105项及1106项下[6]的微生物限度检查法进行微生物限度检查。

1.3.3 水分检查 取益母阿胶膏三批，按照《中国药典》（2015年版）四部通则0832项[6]有关水分的测定方法，采用烘干法分别于第0，1，2，3，6，12月最后一天时取样，进行水分含量测定。

1.3.4 相对密度检查 取益母阿胶膏三批，按照《中国药典》（2015年版）四部通则0601项[6]有关相对密度的检查方法，采用比重瓶法分别于第0，1，2，3，6，12月最后一天时取样，进行相对密度测定。

2 结果

2.1 微生物限度检查方法学验证结果

需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法适应性验证结果见表1，控制菌检查方法适应性验证结果见表2。由结果可知，需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的平均回收率均大于70%，说明采用1∶100的稀释法可以去除益母阿胶膏的抑菌能力，采用稀释法联合平皿法作为微生物限度的检查方法是可行的。而建立的控制菌检查方法结果呈阳性，说明该方法也是可行的。

2.2 益母阿胶膏的长期稳定性实验结果

益母阿胶膏的微生物限度、相对密度、水分含量的检查结果见表3～4。由结果可知，在12个月内，益母阿胶膏的微生物含量均符合《中国药典》（2015年版）的有关要求，而其水分含量和相对密度在12个月内的变化浮动均小于5%，说明其水分含量和相对密度质量情况稳定。

3 讨论

本实验的基本方组成中含有的当归[7]、川芎[8]、桃仁[9]、益母草[10]、炮姜[11-12]等中药均有抑菌性，药物中若污染的微生物，在上述具有抑菌性中药的影响下，常规的微生物限量检查法下有可能出现阴性结果，但是随着时间的推移，当药物中的抑菌成分消除后或浓度降低时，这些微生物便可复苏并繁殖，影响药品质量[13-14]。因此本实验采用常规法进行需氧菌总数检查和控制菌总数检查时，需要先去除药物中的抗菌活性。一般来说，中药制剂采用稀释法和薄膜过滤法以消除其抑菌活性[15]，项目组曾采用稀释法（1∶20，1∶50，1∶100）3个稀释级进行考察，结果发现1：100稀释级的回收率可达到50%～200%，可消除其抑菌活性。

长期以来膏方一直在江浙地区流行，并且服用时基本集中在冬季进补，在岭南地区则难以推广，其主要原因是在于气候问题。因为传统膏方富含糖类等营养成分，并且不添加任何防腐剂，在全国大部分地区的夏季，以及在气候长年炎热潮湿的岭南地区，膏方均难以保存。随着现代科技的发展，冰箱的出现解决了膏方储存的难题，使得膏方这一传统中医剂型得以焕发新活力，在全国推广使用。

而传统中医膏方的制作方法是采用铜锅，直接以明火加热，历经煎煮、浓缩、收膏、凉膏等多个步骤制作而成。由于现代制药车间对于动用明火有严格的规定，必须要有相应的安全配套设施，符合消防安全的有关规定，因此国内大部分制药企业的GMP车间和医疗机构的GPP车间，基本上都不会采用传统的方法制作中医膏方，所以国内采用传统方法制作膏方的医疗机构，其膏方制作室基本上都是非洁净车间，因此考察其质量的长期稳定性，从而判断其安全性就显得尤为重要。

本实验结果表明，在常规传统膏方的储存条件下（陶瓷容器密封包装、冰箱2～8℃条件下储存），在12个月内其水分含量、相对密度及微生物含量均符合《中国药典》（2015年版）的有关规定，并且质量情况稳定。进一步探究传统膏方能够通过长期稳定性试验的原因，与其制作工艺、物质状态、产品包装都密切相关。从制作工艺来说，明火直接煎煮浓缩直至收膏的工艺，长时间的高温沸腾状态可杀灭多种病原微生物；从物质状态来说，膏方其实是一种高度浓缩的半固体状制剂，即膏体处于高渗状态，再加上储存于2～8℃的条件下，微生物的繁殖受到抑制[16]，难以生长；从产品包装来看，选用密封性能好的容器在消毒灭菌后盛装膏方，也有助膏方的质量保持稳定。