荧光定量PCR技术在临床微生物检测中的应用价值

蒋雪纷

（新疆伊犁州友谊医院检验科，新疆 伊犁 835000）

荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基因，使荧光信号通过累积，实现对整个PCR过程的实时监测，达到增强灵敏度，提高监测效率，精准定量检测的效果[1-2]。为探究荧光定量PCR，技术在临床微生物检测中的应用效果，本次研究回顾性分析我院门诊收治的90例患者的临床标本，对其荧光定量PCR技术微生物检测结果进行分析，详见下文描述。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2017年1月-2019年1月间我院门诊收治的90例患者的临床标本，患者中有男45例，女35例，年龄20-75岁，平均（44.28±5.36）岁；病情：泌尿系统感染患者10例，细菌性食物中毒患者6例，上呼吸道感染患者37例，流行性感冒患者27例，肾盂肾炎患者7例，慢性阻塞性肺病患者3例；90份临床标本中粪便标本51份，尿液标本39份。

1.2 方法 患者标本均采用荧光定量PCR技术检测，将样本增菌液（1.5 mL）滴入灭菌Epp管中，震荡均匀，置入高速离心机内进行2 min离心操作，再彻底分离上层清液，加入μL DNA提取液于余下沉淀中，充分摇匀，沸水浴10 min，再置入高速离心机离心操作5 min，去除4 μg上层清液，完成PCR反应，结束后对标本进行扩增检测，操作与检测均严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 粪便标本与尿液标本中微生物检测结果 粪便标本共51份，其中有15株沙门氏菌被检出，阳性率33.33%，有2株肠出血性大肠杆菌0157：H7被检出，阳性率3.92%，10株副溶血性弧菌被检出，阳性率19.61%；尿液标本共39份，其中有4份金黄色葡萄球菌被检出，阳性率10.26%，见表1。

表1 粪便标本与尿液标本中微生物检测结果

2.2 粪便标本与尿液标本中微生物特异性检测结果 各取2株沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157：H7、副溶血性弧菌及黄色葡萄球菌进行试剂盒特异性检测，结果未出现假阳性或假阴性情况，特异性100%；同时对所取菌株进行10倍系列系数PCR技术灵敏度检测，结果表明102拷贝/mL核酸样本能够进行最低核酸检测限度。

3 讨论

荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）技术，是指利用荧光基团加入PCR反应体系中，通过荧光信号的累积对整个PCR的进程进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的检测方法[3]。该技术最早出现于上个世纪90年代的美国，其研究人员通过实时监控整个PCR过程，对起始模板浓度进行了专一、快速、灵敏以及可重复性的精确定量检测，从而开始PCR技术的高速发展时期，随着PCR技术在临床中的应用越来越广泛[4]，其独特的优势得到了广大研究人员的认可与青睐，其中，PCR技术在临床检测与鉴定中的应用主要包括以下几块：

3.1 PCR技术在病毒检测中的应用 目前，PCR技术在多种病毒的临床检测中得到了应用，例如有研究人员通过四重TaqMan荧光定量PCR技术对185份不同基因混合到一起的B型肝炎样本进行检测，结果显示该方法能够对所有基因型进行检测，从而对PCR技术的高精准度进行的验证[5]；此外，还有研究人员收集了临床172份手足口病患者的324份标本，针对人肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型病毒以及肠道病毒EV71型核酸特异性的反转录检测，同时再对上述标本进行荧光定量PCR以及ELISA法检测，结果显示，与反转录检测相比，只有反转录检测方法检测结果与其相近，同时反转录检测与反转录检测灵敏度均高于ELISA检测，由此可以印证荧光定量PCR检测具有高效快捷、特异性强、灵敏度高的优势。

3.2 PCR技术在细菌检测中的应用 近年来，随着传统检测方法对细菌检测与鉴别的缺陷逐渐显露，PCR技术用于临床细菌检测的优势也在逐渐显现。有研究人员利用PCR技术创新了一种分枝杆菌的结合检测方法，并利用该方法对细菌进行了检测测试，与传统涂片染色法及培养法相比，其灵敏度与与特异性分别达到了97.2%与100%，明显超过了传统方法。此外还有研究人员利用双重PCR技术对鼠伤韩沙门菌与肠炎门菌进行检测，结果显示，双重PCR技术检测灵敏度与特异性均为100%，而检测时间较传统检测方法的4-5 d大大缩短，约为8h即可完成检测，大大提高了临床检测的效率，有助于患者的早期治疗，该方法可期待其在未来临床检测中的推广应用；还有研究人员采用分组法将230例无症状者咽拭子标本进行TaqManMGB探针荧光定量PCR法、常规PCR法与常规分离培养法进行检测，检测细菌为脑膜炎奈瑟球菌，结果显示，上述三种方法的阳性检出率分别为10.43%、6.52%以及3.48%，也验证了TaqManMGB探针荧光定量PCR法对于细菌的检出率均高于常规PCR法与常规分离培养法。

3.3 PCR技术在真菌检测中的应用 临床中关于荧光定量PCR检测方法在真菌检测中的应用均有报道。其中有研究人员通过对曲霉菌的18SRNA序列设计引物及探针对临床疑似标本进行检测，结果显示特异性高达100%；有研究人员通过荧光定量PCR方法对异基因造血干细胞移植后侵袭性曲霉菌感染（IA）进行了早期诊断中的评价，结果显示该检测方法敏感性与特异性高达94.4%与100%。

结合本次研究结果：各取2株沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157：H7、副溶血性弧菌及黄色葡萄球菌进行试剂盒特异性检测，结果未出现假阳性或假阴性情况，特异性100%；同时对所取菌株进行10倍系列系数PCR技术灵敏度检测，结果表明102拷贝/mL核酸样本能够进行最低核酸检测限度。

综上，在微生物的临床检测中，荧光定量PCR技术灵敏度强，特异性好，检测效率高，还具有精准缺量的特点，值得推广应用。