筛查RET融合基因在鼻咽癌组织和细胞系中的表达情况

赵东，何磊，张丽平，何静波

（1.包头医学院第二附属医院，内蒙古 包头 014000；2.包头医学院，内蒙古 包头 014000）

研究发现，RET基因移位的细胞系对RET抑制剂敏感，其可能为治疗RET活化肿瘤提供新的选择。本次研究主要探讨RET融合基因在鼻咽癌组织、细胞系中的表达情况，从而为发现新的治疗方式与靶点提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 对2016年6月-2019年6月期间收治鼻咽癌患者60例进行研究，其中包括男性54例、女性6例，年龄为20-74岁、中位年龄46.5岁，组织病理分期为II型11例、III型54例，其中不包括远处转移的患者。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 标本为经过福尔马林固定的石蜡标本，经病理专家重新确认。组织芯片仪进行组织芯片的构建，供体石蜡标本进行切薄片，HE染色，选取供体蜡块标本典型肿瘤区域穿孔2个，进行芯片构建。芯片上的标本参数为：直径1 mm，间距0.1 mm。于3块组织芯片上构建所有标本，每个肿瘤均有对应位点共2个。构建完毕受体石蜡块后，4

μm连续切片并放在载玻片上。鼻咽癌细胞系为S26、S18、

HONE-1、CNE-1、CNE-2以及SUNE-1，均保存于重点实验室，细胞系铺板，秋水仙碱（0.05 g/mL）作用4 h以阻滞细胞周期，多聚甲醛（10%）固定，梯度乙醇脱水。阳性对照物为有KIF5B/RET融合基因的肺癌组织。

1.2.2 FISH检测 56oC烤片上处理石蜡切片，过夜。脱蜡处理后，二甲苯中处理玻片3次，10 min/次，之后将玻片放置于乙醇（100%）中3次，10 min/次。80oC条件下，玻片在预处理溶液中处理10 min，蛋白酶溶液消化15 min后梯度乙醇脱水并自然干燥。2×SSC缓冲液对细胞滴片进行冲洗，持续30 min，乙酸（70%）预处理10 s后，胃蛋白酶（0.008%）消化30 min，甲醛（1%）固定60 s。经处理后的组织标本、细胞系上滴加10 μL探针混合液并将盖玻片盖上，香蕉水泥封片。杂交仪中79oC下变性6 min，37oC条件下杂交过夜。翌日将标本取出，75.5oC条件下，洗脱液快速洗涤2 min，室温下洗涤2次，二脒基苯基吲哚对比染色，荧光显微镜下4oC避光，30 min内评分。HE染色切片上寻找癌细胞区域，物镜下观察FISH标本，寻找HE染色切片同一视野，对信号仔细观察。绿色荧光标记RET基因3’端，红色荧光标记5’端，RET基因融合时，二者重叠，此时染色信号叠加，或表现为黄色，10%以上肿瘤细胞的红绿探针分离则提示RET基因断裂，对每例标本均计数100个肿瘤细胞。

1.5 RT-PCR 试剂盒提取细胞系总RNA，DNA酶将残留DNA去除，对完成的cDNA转录10 ng，进行PCR反应，总反应体系25 μL，其中包括相应缓冲液、1.5 μL dNTP、0.05 mL DNA聚合酶以及上下游引物分别1 μl。95oC下反应1.5 min，94oC下反应30 s，64oC下反应30 s，72oC下反应40 s，共30个循环，72oC下10 min延申。PCR产物进行琼脂凝胶电泳，扫描电泳条带的密度。

2 结果

60例组织标本、6株细胞系中未见探针分离现象。6个鼻咽癌细胞系中，PCR产物核酸电泳见溴化银显色，未见扩增条带。

3 讨论

当前对RET基因进行检测时，免疫组化、FISH、PTPCR都是比较常用的方法[1-3]。FISH检测时，仅需要石蜡切片即可进行检测，其具有简单、快捷的优势，结果明确、直观，比较适合于不容易获得新鲜标本的病例；PT-PCR的优势在于可靠、敏感，其能够获知基因融合类型，但是其对标本要求比较高，要求为新鲜组织，过程比较繁琐。进行RET基因状态检测时，应结合病情需要来制定决策。

鼻咽癌患者无论是复发还是初诊都常见表皮生长因子受体（EGFR）过度表达，EGFR过度激活造成下游信号被激活，从而促进细胞增殖；EB病毒的感染使得EGFR核内转移以及内化，这说明EGFR在鼻咽癌的发生与发展过程中的作用。但是对EGFR信号通路进行抑制，并未对鼻咽癌细胞的增殖造成影响，这说明可能还有其他信号通路参与了病理生理过程。血管生长因子、缺氧相关蛋白碳酸酐酶-9以及缺氧诱导因子1也都在鼻咽癌组织中高表达，其都提示着预后不良。但是当前仍然缺乏鼻咽癌转移、进展、复发的分子机制。从本次研究的结果上看来，RET基因断裂融合现象并未见于鼻咽癌组织、细胞系中，这说明鼻咽癌发生RET基因融合的可能性较低。

综上所述，鼻咽癌的发生与发展过程中，RET基因并未参与其中。