高铁血红蛋白还原试验在G6PD缺乏症女性杂合子筛查中的应用价值

胡玲玲，李磊，周颖娟

（珠海市妇幼保健院检验科，广东 珠海 519000）

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症是常见的遗传性酶缺乏疾病，为X连锁不完全显性遗传病，我国各地区发病率有较大差异，高发区集中在长江流域以南[1]。致病基因位于Xq28[2]，由13个外显子和12个内含子组成，因女性有两个X染色体，故有两个G6PD基因，女性的基因型分为正常，缺乏杂合子以及缺乏纯合子，因两个X染色全部缺陷的可能性较小，故女性G6PD缺乏的主要形式是以杂合子存在。G6PD缺乏杂合子酶活性变化范围较大，可以表现为正常、中度缺乏和重度缺乏，而男性半合子G6PD缺乏活性一般呈显著性缺乏，严重者可导致新生儿期核黄疸，引起死亡或永久性神经系统的损伤[3]。现阶段各实验室用于G6PD缺乏筛查的主要方法为高铁血红蛋白还原法和荧光斑点法。本研究收集2019年5月-9月期间前来本院进行孕前检查的2096份女性标本，应用上述两种方法作为初筛试验，并对所有样本应用高分辨熔解曲线法作为G6PD缺乏症的确证实验，以期评价上述两种常用初筛方法在G6PD缺乏女性杂合子筛查中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象 2019年5月-9月期间前来珠海市妇幼保健院进行孕检的珠海籍女性2096人，年龄为22-40周岁，血红蛋白检测值均在115-150 g/L。采用EDTA抗凝真空管抽血3 mL。

1.2 方法

1.2.1 G6PD荧光斑点法 将血滴入滤纸片形成血斑待干燥，用打孔器在血片上打下一直径3 mm的血片于反应试管中，加入反应混合液100 μL，置37oC孵育箱中10 min，取约2.5 μL血斑混合反应液滴于滤纸上，用风筒吹干后置于紫外灯下观察荧光情况。结果判断：荧光强度++时，荧光斑点光亮，判断为G6PD正常；荧光强度+--时，为G6PD缺乏阳性，判断为轻-中度缺乏；斑点暗淡表示无荧光，判断为重度缺乏。

1.2.2 MHB-RT法 按第3版《全国临床检验操作规程》方法进行试剂配制和操作，试剂为1.25%亚硝酸钠葡萄糖、0.0004 mol/L美兰溶液。结果判断：高铁血红蛋白还原率＜75%为缺乏阳性，≥75%为正常。

1.2.3 荧光PCR熔解曲线法 采用厦门致善生物技术有限公司的G6PD基因检测试剂盒，可检出中国人群常见的16种突变类型，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包进行率的比较。采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MHB-RT法和荧光斑点法检出率 对2096例孕检女性进行G6PD筛查检测，女性阳性检出率为12.36%。荧光斑点法筛查时，阴性标本2040例，阳性标本56例，高铁血红蛋白还原率≥75%的样本有1852份（即阴性结果有1852份），高铁血红蛋白还原率＜75%的标本有244份（即阳性结果有244份）；两种方法阴性符合率为90.8%。其中荧光斑点为中到重度缺乏的样本用MHB-RT法可100%检出。见表1。

2.2 MHB-RT法与荧光PCR法 采用高分辨荧光熔解曲线法对MHB-RT阳性样本进行批量检测，其中222例基因确诊阳性，22例为正常，假阳性率为1.2%，余1852例MHB-RT阴性样本有37例确诊为G6PD缺乏患者，假阴性率14.3%，检测灵敏度为85.7%（222/259），特异度为98.8%（1815/1837）。基因突变位点分别为：c.1376G＞T 102例，c.1388G＞A 93例，c.95A＞G 34例，c.1024G＞T 19例，c.871G＞A 7例，c.392G＞T 2例，c.1388 G＞A/95A＞G 1例，c.1388G＞A/1024 G＞T 1例。MHB-RT法与高分辨荧光熔解曲线法检测结果比较，其检出率经χ2检验可知χ2=0.508，P=0.476，说明两种方法比较，差异无统计学意义，其吻合性经Kappa系数检验可知K=0.916，P=0.001，说明两种诊断方法的吻合度有统计学意义，见表2。

表1 MHB-RT和荧光斑点法检测结果（例）

表2 MHB-RT和高分辨荧光熔解曲线法检测结果（例）

2.3 荧光斑点法与荧光PCR法 在荧光斑点试验阴性的2040例样本中有212例为基因确诊阳性，假阴性率为81.9%，56例样本中有9例假阳性，假阳性率为0.5%。检测灵敏度为18.1%（47/259），特异度为99.5%（1828/1837）。荧光斑点法与高分辨荧光熔解曲线法检测结果比较，其检出率经χ2检验可知χ2=141.451，P=0.000，说明两种方法比较，差异有统计学意义，其吻合性经Kappa系数检验可知K=0.266，P=0.000，说明两种诊断方法的吻合度较差，差异有统计学意义。检测结果见表3。

表3 荧光斑点法和高分辨荧光熔解曲线法检测结果（例）

2.4 荧光斑点与MHB-RT法 G6PD荧光斑点活性与MH-RT检测结果比较，检出率经χ2检验可知χ2=10.044，P=0.002，说明两种方法比较，差异有统计学意义。因为检测方法敏感性的不同，两方法对女性杂合子检出率存在差异。

3 讨论

G6PD缺乏症由于无法根治，只能对症治疗及预防发病，故在人群中特别是产检和婚检中进行快速有效的筛查显得尤其重要。本文主要是探究荧光斑点法和高铁血红蛋白还原法两种初筛试验在女性杂合子携带者中的优越性差异。因男性半合子和女性纯合子G6PD缺乏时，其酶活性常常为重症缺乏，荧光斑点法和高铁血红蛋白还原法对于此类缺乏者筛查敏感性均为100%，两种方法无明显差异。对于女性杂合子的筛查，MHB-RT法有着较高的灵敏度，与G6PD确诊检测方法荧光PCR法相比检出率无明显差异，且与确诊方法吻合度较高。而荧光斑点检测方法假阴性率较高，漏诊情况严重，其检出率与确诊方法相比差异有统计学意义，且吻合度较差，不符合初筛试验应具有较高灵敏度的要求，故MHB-RT法对女性杂合子G6PD缺陷的初筛效果明显优于荧光斑点法。我们通过研究发现，在合适的底物浓度和反应温度下，反应时间更为重要[4]。这是由于部分属于轻、中度缺陷的杂合子患者红细胞中NADPH生成不足，硝基四氮唑蓝不能充分还原。在筛查过程中易于将这部分属于轻、中度缺陷的女性杂合子漏检。在实验中我们发现G6PD筛查的样本最好能在24 h内检测，必要时洗涤红细胞以排除白细胞和血小板的影响。据报道，c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.871G＞A几个热点突变，检出率可达70%，本研究中，上述四种突变点检出率达到91.1%，略高于文献报道检出率[5]，本地区突变以1376G＞T为主，为本地区女性携带者中的突变热点。

荧光斑点实验需要长波紫外光灯及氧化型谷胱甘肽（GSSG），判断结果受主观因素影响大[6-7]，MHB-RT法成本低，方法简便，实验稳定，应用MHB-RT法检测女性G6PD缺陷，能更客观更准确筛查G6PD缺陷症，尤其对女性杂合子的早期筛查、早期诊断、早期预防提供可靠的诊断依据，减少漏诊和误诊。在疾病高发地区可开展G6PD缺乏症的产前酶活性筛查，为育龄人群提供G6PD缺乏症的宣传教育和遗传咨询[8]。特别是在基层医院中，由于仪器设备等限制，MHB-RT法不失为快速筛查G6PD缺陷症的好方法[8]。本研究中，由于样本均为女性，所以对本地区的G6PD缺乏率仍需更大样本量待进一步研究。