鱼类水霉病病原菌LY04对环境及营养的适应性

段魏魏 申慧 魏冬梅

摘要：以标准菌株ATCC 26116为对照组，采用单因素试验方法分别探讨菌株LY04对温度、pH值、盐度的环境适应性以及对碳源、氮源的营养适应性。结果显示，菌株LY04与对照株在10～30 ℃的温度范围、5～9的pH值范围内均可生长，但二者在相同环境条件下生长速率差异显著，LY04较对照株对温度、pH值的适应性差，盐度适应性优于对照株;二株菌对营养的要求差异显著，在相同营养条件下，LY04菌株生长速率显著快于对照株，试验株对寡营养适应性优于对照株;NH+4-N在质量浓度0.1%～0.3%范围内对二株菌生长均有促进作用，NO3-N对菌株LY04的生长有抑制作用，在0.1%质量浓度下可以促进对照株的生长，其余浓度也表现出明显的抑制作用。综上，菌株LY04具有很好的环境适应性和营养适应性，这些适应性都与新疆独特的水域环境相适应。

关键词：水霉;病原菌;环境;营养;适应性

中图分类号： S941.43+1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）03-0190-04

水霉病是各种水产养殖中广泛存在的一种寄生性疾病，是防治难度最大的鱼类病害之一，每年给养殖业带来巨大的经济损失[1-2]。由于其特效防治药物孔雀石绿的禁用，其危害更加普遍和严重[3-4]。目前，硫酸铜、臭氧、福尔马林、重氢硫酸盐等各种化学试剂及各种中草药、微生物抗菌剂广泛用于水霉病防治，但大多只起到预防作用[5-11]。在寻找水霉病防治的有效途径时，了解其病原是必须的。研究认为，水霉病的病原常见的有水霉、绵霉和腐霉[12-13]，具有多样性，对寄主无严格选择性。

国内外大量学者对水霉病病原菌生理特性的研究表明，其环境适应范围广，5～32 ℃温度范围[14-16]、4～11的pH值范围[17-18]、3.5%以内的氯化钠[14，19-21]含量条件下均可生长。新疆独特的气候特点使鱼类在历经严冬后的初春易患水霉病，鱼类水霉病的病情较我国其他地区更为严峻，而目前未见相关研究见诸于众。本研究对新疆五家渠地区水霉病病原菌的环境适应性进行探讨，以期为了解病原进而找到合适的防治水霉病药物提供数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 菌种：LY04，从五家渠患水霉病鲢鱼肌肉及体表分离获得，根据形态学及生理学特征鉴定为水霉目、水霉科、水霉属[22];标准菌株，多子水霉（saprolegnia fex）ATCC 26116，购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（pH值 7.0），用于水霉的培养及环境适应性试验;沙堡氏琼脂培养基（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g，纯净水1 000 mL，pH值5.6±0.2），用于营养适应性试验。

1.2 试验方法

1.2.1 环境适應性试验方法

1.2.1.1 温度对水霉菌生长的影响 用微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺的水霉菌菌落后重新接种在新的PDA培养基中央。然后分别置于10、15、20、25、30 ℃下恒温培养72 h，用十字交叉法测量菌落直径（mm），计算生长率（%）。每组重复3次，用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。

1.2.1.2 pH值对水霉菌生长的影响 配制PDA培养基，常规灭菌后，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH调节pH值分别为5、6、7、8、9。采用微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺的水霉菌菌落后重新接种在灭过菌的不同pH值的PDA培养基中央。然后置于25 ℃下恒温培养72 h。用十字交叉法测量菌落直径（mm），计算生长率（%）。每组重复3次。用GraphPad Prism软件进行统计分析。

1.2.1.3 盐度对水霉菌生长的影响 用微生物平板打孔器在培养有水霉菌PDA培养基上，轻轻打取长势较旺的水霉菌菌落后，分别接种于含NaCl质量分数为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的PDA平板中央，然后置于25 ℃恒温培养48 h后，用十字交叉法测量菌落直径（mm），计算生长率（%）。每组重复三次，用GraphPad Prism软件进行统计分析。

1.2.2 营养条件适应性试验方法

1.2.2.1 葡萄糖对水霉菌株生长的影响 采用灭过菌的微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺较一致的水霉菌菌落后，接种在葡萄糖质量浓度为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的沙堡氏琼脂培养基（去掉了葡萄糖组分）中央。然后置于25 ℃温度条件下恒温培养，分别观察24、48、72 h的生长情况并用十字交叉法测量菌落直径，每组3个平行。

1.2.2.2 蛋白胨对水霉菌株生长的影响 采用灭过菌的微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺较一致的水霉菌菌落后，接种在蛋白胨质量浓度为0.0%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%的沙堡氏琼脂培养基（去掉了蛋白胨组分）中央。然后置于25 ℃下恒温培养，分别观察24、48、72 h的生长情况并用十字交叉法测量菌落直径，每组3个平行。

1.2.2.3 硫酸铵对水霉菌株生长的影响 采用灭过菌的微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺较一致的水霉菌菌落后，接种在含硫酸铵质量浓度为0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏琼脂培养基中央，后置于25 ℃下恒温培养，分别观察24、48、72 h的生长情况并用十字交叉法测量菌落直径，每组3个平行。

1.2.2.4 硝酸钾对水霉菌株生长的影响 采用灭过菌的微生物平板打孔器在培养有水霉菌的PDA培养基上，轻轻打取长势较旺较一致的水霉菌菌落后，接种在含硝酸钾质量浓度为0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的沙堡氏琼脂培养基中央。然后置于25 ℃下恒温培养，分别观察24、48、72 h的生长情况并用十字交叉法测量菌落直径，每组3个平行。

2 结果与分析

2.1 环境适应性结果

2.1.1 温度对水霉菌生长的影响 微生物的生长繁殖有其适宜的温度范围，培养温度过高或过低，都会造成微生物生长缓慢，甚至导致微生物的死亡。温度对2株水霉菌株生长的影响见图1。由图1可知，菌株LY04及标准菌在10～30 ℃范围内均可生长。菌株LY04在为25 ℃达到最大生长速率，标准菌株在20 ℃和25 ℃时生长最好且其生长速率在同温度下高于菌株LY04。

2.1.2 pH值对水霉菌生长的影响 pH值对微生物的影响是多方面的，它不仅可以影响微生物对物质的吸收能力，还可以影响酶的活性。过酸或过碱的环境会导致微生物生长缓慢甚至导致微生物死亡。pH值对2株水霉菌株生长的影响见图2。由图2可知，菌株LY04和标准菌在pH值5～9范围内均可生长，对于酸碱环境的适应性较强，菌株LY04在pH值=7时生长最好，标准菌在pH值=6时生长最好。在相同pH值条件下，标准菌株的生长速率高于菌株LY04;但试验菌株对酸碱变化更敏感。

2.1.3 盐度对水霉菌生长的影响 海水中鱼类水霉病的发生率很低，如受水霉菌感染的鳟鱼，当回到海水时，水霉病症状逐渐消失，说明水霉病原菌对盐度敏感。盐浓度对2株水霉菌株生长的影响，由图3可知，菌株LY04在NaCl质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%时生长被促进，而在NaCl质量分数为2.5%时生长被抑制，最适NaCl质量分数为1.5%; 标准菌株在NaCl质量分数为0.5%～2.0%范围内生长几乎不受影响，当盐度达2.5%时生长显著被抑制。在相同盐度条件下，试验株的生长速率显著高于对照株。

2.2 营养条件适应性试验结果

2.2.1 葡萄糖对水霉菌生长的影响 葡萄糖不仅为生物的生长提供细胞的碳架，还提供细胞生命活动所需要的能量。在微生物的培养基中一般都过量添加葡萄糖，但过量的葡萄糖对微生物的生长是有影响。葡萄糖对2株水霉菌株生长的影响见图4。由图4可知，在不添加葡萄糖时蛋白胨中的碳源就可使2个株菌生长，在有蛋白胨的培养基中只需添加少量葡萄糖即可使水霉菌生长旺盛（0.5%与对照相比 P<0.05）。在相同条件的同一葡萄糖浓度下，菌株LY04的生长较标准菌株旺盛。

2.2.2 蛋白胨对水霉菌生长的影响 氮是微生物必需的营养物质之一，蛋白胨主要作为氮源用于微生物的培养。蛋白胨对2株水霉菌生长的影响见图5。由图5可知，2株菌在不添加蛋白胨时均不生长;菌株LY04在0.5%的蛋白胨下，生长速率显著提高，0.8% 时达到饱和;标准菌在0.7%的蛋白胨下，生长速率显著提高，0.8%时达到饱和。在相同条件的同一低浓度蛋白胨下，菌株LY04生长较标准菌旺盛。

2.2.3 硫酸銨对水霉菌生长的影响 众多研究表明，真菌生长时对不同形态的氮盐利用效率不同。NH+4-N以还原态形式存在，添加在培养基中主要增加还原态的氮。硫酸铵对2株水霉菌生长的影响见图6。由图6可知，0.1%～0.3%浓度范围的硫酸铵对2株菌的生长起促进作用，硫酸铵浓度高于 0.5% 时开始抑制菌株生长，即2株菌在一定浓度范围内对铵态氮有偏好。相同条件同一浓度硫酸铵条件下，2株菌生长差异不明显。

2.2.4 硝酸钾对水霉菌生长的影响 硝态氮是氮元素的另外一种存在形式，为氧化态氮。在培养基中添加硝酸钾，主要增加氧化态的氮。硝酸钾对2株水霉菌生长的影响见图7。由图7可知，添加硝酸钾菌株LY04的生长受到抑制;标准菌株仅在0.1%的硝酸钾条件下生长稍有促进，增加浓度其生长被抑制菌。

3 讨论

3.1 水霉病原菌的环境适应性

试验菌株LY04在10～30 ℃温度范围、5～9的pH值范围内均可生长，对温度和pH值的适应性较广。与标准菌株相比，温度、pH值对试验菌株LY04影响更大，在相同的温度、pH值条件下，试验菌株的生长速率要慢于标准株，当温度达到适温时，试验菌株生长迅速增快，这与鱼类水霉病的发生有对应关系，说明试验菌株对新疆独特的水域环境有高度的适应性。在初春时节，鱼类由于越冬时的冻伤易感水霉病，但病情发展缓慢，这与此时温度较低，水霉菌生长缓慢相关;初夏时节，在鱼类繁殖期，水霉菌大量侵袭鱼卵，造成水霉病暴发，此时池塘水温恰与水霉菌最适生长温度一致。在相同的外界条件下，菌株LY04对盐度较标准菌有更好的忍耐性，生长速率均好于标准株，说明试验菌株对盐度也有更好的适应性。新疆的气候条件导致新疆水域环境较高的盐碱度，从分离获得的菌株来看，新疆水霉病原菌都具有良好的盐碱抵抗力，因而在新疆鱼类水霉病的防治难度更大。

3.2 水霉病原菌的营养适应性

水域环境条件对于微生物生长来讲应该属于贫营养，通过营养条件适应性试验发现，水霉病原菌对营养条件的要求确实较低，2株菌在不存在任何形式的糖时仍可生长;对氮源的要求也很低，低浓度的蛋白胨就可以使2株菌迅速生长，说明2株菌对贫营养的适应性都较好，相对而言，试验菌株LY04在相同营养条件下生长速率明显高于标准菌株，说明试验菌株在贫营养环境中更易生长。新疆水域由于盐碱度较大，生物丰富度相对小，因此水域的营养条件相对贫瘠，试验菌株对贫营养的耐受恰好与此吻合。

3.3 不同形式氮源的存在对水霉病原菌的影响

氮作为地球上存在最多的元素，可以氧化态、还原态、氧化-还原态多种形式存在。许多研究都表明，生物可以利用不同形式的氮源。对于水霉病病原菌而言，尚未见此方面的研究报道。本研究在添加了蛋白胨的培养基中分别添加硫酸铵、硝酸钾，以便探讨试验菌株对不同形式的氮的利用情况。由结果可知，2株菌都表现出了对铵态氮的更好利用，硝态氮则表现出了抑制作用。水域环境由于溶解氧的限制，一般处于还原状态，2株菌都能更好地利用还原态氮——铵态氮，也说明水霉病原菌对水环境的良好适应性。

综上所述，发现试验菌株具有很好的环境适应性和营养适应性，这些适应性都与新疆独特的水域环境相适应;对照菌株也表现出了较强的适应性，这也许是鱼类水霉病广泛发生的主要原因。

参考文献：

[1]Tampieri M P，Galuppi R，Carelle M S，et al. Effect of selected essential oils and pure compounds on Saprolegnia parasitica[J]. Pharmaceutical Biology，2003，41（8）：584-591.

[2]孟思妤，孟长明，陈昌福. 鱼类水霉病的发生原因与预防措施[J]. 渔业致富指南，2016（15）：60-61.

[3]王发荣. 水库鱼种水霉病综合防治[J]. 农业与技术，2017，37（14）：112.

[4]黎姗梅. 水产养殖中水霉病的防治[J]. 科学养鱼，2017（2）：91.

[5]Forneris G，Bellardi S，Palmegiano G B，et al. The use of ozone in trout hatchery to reduce saprolegniasis incidence[J]. Aquaculture，2003，221（1/2/3/4）：157-166.

[6]Straus D L，Farmer B D，Ledbetter C K，et al. Use of copper sulfate to control egg saprolegniasis at a commercial sunshine bass hatchery[J]. North American Journal of Aquaculture，2016，78（3）：243-250.

[7]Gieseker C M，Serfling S G，Reimschuessel R. Formalin treatment to reduce mortality associated with Saprolegnia parasitica in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture，2006，253（1/2/3/4）：120-129.

[8]Ali E H. Morphological and biochemical alterations of oomycete fish pathogen Saprolegnia parasitica as affected by salinity，ascorbic acid and their synergistic action[J]. Mycopathologia，2005，159（2）：231-243.

[9]宋学宏，陈 葵，王永玲，等. EM及重氢硫酸盐对黄颡鱼卵孵化中水霉的抑制作用[J]. 淡水渔业，2007，37（1）：9-12，18.

[10]刘永涛，艾晓辉，杨秋红，等. 15种中草药超临界CO2流体萃取物对2种水霉菌的抑制作用研究[J]. 淡水渔业，2015，45（3）：40-45.

[11]宋增福，范 斌，佘林荣，等. 一株具水霉抑制特性的芽孢杆菌筛选及其分子生物学鉴定[J]. 淡水渔业，2012（3）：28-31.

[12]Hсаева Н М，李永芳.鱼类的霉菌病[J]. 国外水产，1993（3）：13-16.

[13]王立宝，刘文霞，左万星，等. 松萝酸对3种水霉病致病菌的抑菌作用[J]. 河北师范大学学报（自然科学版），2017，41（4）：354-357.

[14]Hatai K，Willoughby L G，Beakes G W. Some characteristics of saprolegnia obtained from fish hatcheries in Japan[J]. Mycological Research，1990，94（2）：182-190.

[15]Koeypudsa W，Phadee P，Tangtrongpiros J，et al. Influence of pH，temperature and sodium chloride concentration on growth rate of Saprolegnia sp.[J]. Journal of Scientific Research at Chulalongkorn University，2005，30（2）：123-130.

[16]甄 珍，王 荻，刘红柏，等. 山女鳟水霉病病原的分离鉴定及其生物学特性[J]. 江西农业大学学报，2015，37（2）：333-338.

[17]熊 刚，尹思璐，梁永增，等. 河鲈水霉病病原菌的研究[J]. 安徽农业科学，2013，41（8）：3411-3413，3439.

[18]夏文伟，曹海鵬，王 浩，等. 彭泽鲫卵源致病性水霉的鉴定及其生物学特性[J]. 微生物学通报，2011，38（1）：57-62.

[19]杨伟杰，薛鹏伟，邵 伟，等. 大西洋鲑水霉病盐浴治疗初步研究，河北渔业2017（2），37-39

[20]Hussein M M A，Hatai K.Pathogenicity of Saprolegnia species associated with outbreak of salmonid saprolegniosis in Japan[J]. Fisheries Science，2002，68：1067-1072.

[21]张书俊，杨先乐，李 聃，等. 施氏鲟水霉病病原的初步研究[J]. 中国水产科学，2009，16（1）：89-96.

[22]熊 刚，黄奕童，王咏星. 新疆五家渠水霉病原菌多样性的初步研究[C]//第九届全国微生物学青年学者学术研讨会论文集. 武汉，2012.