根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展

李俊香 古勤生

摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化是近20年来真菌研究的主要技术之一。农杆菌介导转化（ATMT）技术已广泛应用于随机突变试验中，以确定哪些基因是真菌与昆虫、植物、哺乳动物甚至其他真菌的致病相关基因。该技术广泛地应用于正向和反向遗传学，使得许多真菌基因功能得以阐明。尽管ATMT技术影响深远，但该技术作为一种转化工具在真菌中的应用并不均衡。本文综述了ATMT技术在发掘真菌功能基因方面的最新进展，以及它的优点和局限性。

关键词：根癌农杆菌;丝状真菌;遗传转化;ATMT技术

中图分类号： Q949.32;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）03-0043-06

1998年，Dunn-Coleman等在《Nature Biotechnology》杂志上发表了一个评论，介绍了真菌上应用的一个新的转化技术，即利用根癌农杆菌将外源的DNA转入到丝状真菌中[1]。当外源DNA转入真菌进而整合到真菌基因组的过程中有可能破坏一个关键的基因而引起性状的改变，据此可以了解有关真菌基因或多或少的信息。将根癌农杆菌应用于真菌的遗传转化，这一非凡创举早在1995年于模式生物酿酒酵母中首次被证实[2]，1996年利用农杆菌转化了酵母[3]，1998年将这一植物病原细菌成功应用于子囊菌和担子菌等7种丝状真菌的转化中[4]。从1995年第一次报道根癌农杆菌介导真菌遗传转化到2005年，10年间，该技术已成功应用于50余种真菌[5]。此后10年，根癌农杆菌介导的遗传转化在真菌中的应用不断扩大，在许多真菌中甚至作为一种标准的试验技术进行基因操作。有些真菌，农杆菌介导转化（ATMT）技术是最容易甚至是唯一的一种引入外源DNA的试验技术。在其他真菌种类中，ATMT成为一种强大的正向遗传学技术，用于构建携带 T-DNA随机插入标签的突变体库并用于基因分析，抑或用于反向遗传学构建特定靶基因替代的突变体，还可操控基因的表达以取得生物工程方面的效益。了解这项技术是如何应用的能够指导或预测未来技术在真菌中的应用，从而推进真菌方面的研究。

1 根癌农杆菌及其介导的真菌遗传转化

根癌农杆菌是一种植物病原菌，属于α-变形菌，是自然界中一种天然的能创造转基因生物的介体。在这个过程中，根癌农杆菌将质粒的一个DNA片段插入到宿主植物细胞核基因组中，自然界里，这段细菌的DNA能够编码蛋白质用于改变植物的生长而利于自己的繁殖[6]。在大多情况下，这会导致植物形成非增生性的瘿或瘤，被改变的受体基因组通常不会遗传给后代植株。然而，甘薯基因组分析表明，在很稀有的情况下，这些转化事件能够更永久地融合进受体植物基因组并遗传下去[7]。农杆菌属细菌属于根瘤菌科，更接近于能与植物形成共生关系固定空气中氮素的根瘤菌属细菌。根癌农杆菌又被命名为放射型根瘤菌[8]，但真菌转化领域使用该物种作为转化介体时依旧使用根癌农杆菌这个名字。

在基因组测序工程发展以前，唯一已知的基因水平转移的例子，便是根癌农杆菌介导的基因从细菌转化整合到真核生物基因组中[9]。根癌农杆菌天然地存在于自然环境中，这些细菌周围存在很多寄主，其中包括很可能恰好出现在植物伤口附近的真菌，受伤的植物能够诱导T-DNA从细菌到真菌的转移。Knight等先在植物材料上共培养了植物病原真菌黄萎病病菌和含有质粒的能潜在转化真菌的根癌农杆菌，然后在植物细胞中观察被转化的真菌，研究证明，这样的基因转化事件在自然环境中发生是完全可能的[10]。当然，自然界中，这样将有益的DNA片段转化到真菌里的事件发生的概率是很小的，所以这样的转化事件很可能不具备选择优势，但有趣的是可以在进化的时间尺度上计算这种事件发生的频率。实际上，除了植物[7]，基因组测序发现，一些真菌基因组，如米曲霉菌基因组序列信息上发现了根癌农杆菌类似DNA序列[11]。

植物分子生物学家将野生型根癌农杆菌改造成自己喜好的菌株。细菌菌株和遗传物质被修改，一方面阻止寄主植物根瘤的形成，另一方面将质粒上可以被转化到植物基因组上T-DNA的左右边界各添加25 bp的重复序列。从细菌遗传学角度，而不是能更精确描述T-DNA从细菌到真核寄主基因组转移的这种转化整合方法的角度看，这种基因整合机制可以在不同的物种间发生。根癌农杆菌寄主的多样性，能够使其应用到模式物种拟南芥以外的许多不同的真核物种当中，如真菌就是最好的例子[9]。

笨拙的载体系统是根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术发展中最初的限制因素之一。一些根癌农杆菌载体非常难操作，因为这些载体是针对介导植物遗传转化开发的，其上携带传统克隆技术需要的有限的限制性酶切位点，这些限制性酶切位点便于预先设置植物转化上特殊需要的调节因子。幸运的是一些适用于植物遗传转化的载体中也包含一些小的载体，这些载体便于操作，因为它们含有未曾修改的T-DNA区域。一些改进的载体构建方法，如酿酒酵母中的酵母重组[12-14]，Gateway系统[15]和Golden Gate组装技术[16]，使载体构建和改造变得既簡单又高通量。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的另外一个限制因素是早期使用的那些载体能够插入的DNA长度有限，这对于大基因片段的互补是一个很大的技术限制。这个问题的解决办法之一是使用双元细菌人工染色体（BIBAC）技术系统，这个技术系统能够将任何一个含有真菌DNA大片段序列的人造细菌染色体修改成含有左右边界序列的大片段，从而实现真菌的直接转化。例如，使用这种方法成功地将75 kb的大DNA片段转化整合到黄瓜尖孢镰刀菌基因组中[17]。一个相似的系统，即将人造细菌染色体转变成适用于玉蜀黍黑粉菌遗传转化的载体系统也被开发[18]。

2 ATMT相对于其他转化技术的优点

早在ATMT技术应用于真菌之前，真菌中使用其他转化方法，例如聚乙二醇或阳离子聚乙二醇介导的原生质体转化[19-20]。然而，ATMT技术相对于这些转化技术改进了许多，这也解释了在许多真菌中为什么选择ATMT作为转化工具。

首先，ATMT技术不需要去除真菌细胞壁制备原生质体。然而，在一些真菌种类中，当其他转化方法难以实现或者不稳定时，原生质体转化依然是一个备选方案。不同的真菌有不同的细胞壁，并且在真菌的不同生长和发展阶段细胞壁也不同。这也解释了为什么在不同的真菌种类中，原生质体转化容易成功，但是这对于解决寻找合适细胞壁降解酶困难方面并没有什么帮助。相反，虽然根癌农杆菌对细胞类型有偏好性，但是，农杆菌可以转化的细胞种类很多，包括哺乳动物细胞[21]、卵菌细胞[22]，以及许多真菌不同组织和类型的细胞。

ATMT技术优于其他转化方法的第二个突出特点是，T-DNA可以随机地插入到基因组中。因此，ATMT技术的主要影响源自其为随机突变能为正向遗传筛选提供资源。除了ATMT技术，REMI技术也引起插入突变。但是REMI技术，在DNA转入原生质体细胞这个阶段需要限制性内切酶。另外，REMI技术在应用中存在许多问题，例如，突变与插入的DNA片段没有关系，而是因为限制性内切酶引起了DNA损伤。其他的插入突变技术包括转座子插入，但是这个方法往往需要根据不同的物种设计特殊的结构。在真菌随机插入突变转化方法上，ATMT技術在很大程度上取代了REMI技术[5]。因为在ATMT技术中，T-DNA通常以单拷贝插入的形式整合到基因组中，所以，任何一个表型改变的突变体都很可能是由于插入引起的。通过筛选 T-DNA 插入突变体库，获得表型突变体，然后采用不同的方法通常是PCR技术获得T-DNA插入位点左右侧翼序列，来辨别受影响的基因。T-DNA插入引起的突变，基因功能鉴定程序通常是：如果突变没有影响性周期，则连锁分析T-DNA突变体和对应交配型菌株的后代;根据研究机体选择合适的转化技术对靶标基因进行等位替代;用一个野生型基因进行互补试验。

ATMT技术还可以采用反向遗传学的方法删除或破坏目的基因。这不同于随机插入突变，因为转化载体上添加了DNA序列，这些序列含有受体基因组的特异位点，可以调节外源同源互补序列。因此，ATMT技术可以在所需要的基因组区域尤其是在一个假定的开放阅读框处进行基因替换。ATMT常常发生在非同源末端连接的DNA修复过程[23]。这个过程产生的突变增加了基因替换转化子的比例。在过去的10年里，迅速增加的公共的可以利用的真菌基因组序列[24]，使得通过分析目标基因的删除来鉴定单个或基因家族相对容易。同一时期，出现了许多新的分子研究技术，其中包括诱导型启动子系统[25]、可回收标记[23]，以及最新的CRISPR-Cas基因编辑[26]。这些技术使得基因组功能分析达到高通量水平，使产业得以驯化，疾病发生关键过程以及许多真菌假定药物靶点的分析进入系统水平[27]。因此，使用ATMT技术对真菌基因组进行针对性的操作是一个非常关键的技术，这将利于实现更多近期的突破。

最后，这个容易转化的方法，对基因功能的发掘实现了公平竞争，而不是由模式生物主导的分子生物学试验。对于非传统物种，一旦基因组序列可用，这种技术将变得非常实用。

3 ATMT技术在真菌中的研究趋势

2005年，Michielse等在发表的一篇综述里描述了ATMT技术的转化特点[5]，然而，接下来的10年，一些研究趋势还在继续，更多焦点还是共培养条件对转化效率的影响，例如，细菌和真菌细胞浓度，共培养时间和温度以及受伤植物根释放的可以促进农杆菌转化的代谢产物乙酰丁香酮的浓度。专注于转化效率主要是为了与原生质体转化和其他转化方法作比较，因此努力优化转化条件以求获得最高的转化效率。然而，这并不重要，因为ATMT转化过程简单，如果需要更多的转化株，可以增加转化次数。相反地，ATMT方法是一个理想的转化方法，因为采用该技术做转化能够快速获得一个单拷贝插入突变体库，并且感兴趣的突变体表型与基因突变相关，但是很少有研究表明，获得的转化子数量是否与单个转化子的T-DNA插入次数相关。目前更多的刊物趋向于报道在某个物种中首次成功使用ATMT转化技术，而很少有出版物报道如何合理地实施该技术以获得基因突变或者用于其他目的。考虑到ATMT技术成功转化的真菌只是种类繁多的真菌中的一小部分，所以仍旧有很多的未开发的资源等待发掘。

4 ATMT技术存在的问题和局限

前面突出强调了ATMT转化技术的使用给真菌领域带来的新的大的进步。然而，这个转化技术也不尽完美，研究者在使用该技术设计正向遗传学试验，替换靶标基因或分析从突变菌株获得的解释数据时应该考虑到这个技术的局限性。

考虑到产生成千上万个突变体是功能基因组研究的先决条件，所以要从几个方面对ATMT转化技术进行改进以克服重大试验的局限性，并确保这一技术非常高通量。然而在一些情况下，技术挑战是不可避免的。例如，虽然96孔板的应用促使醋酸锂或聚乙二醇介导的原生质体转化变得高通量化[28]，但是，采用ATMT技术进行相似地转化试验时，却不能使用96孔板模式。其中的技术挑战可能是微型化培养的根癌农杆菌不能使其在转化之前达到最佳的生长阶段。然而，在减少用于ATMT转化技术试验的根癌农杆菌密集型克隆负担方面已经取得了许多进步，这多亏于根癌农杆菌兼容质粒的出现。与醋酸锂或聚乙二醇介导的原生质体转化相比，这样的克隆更具挑战性，因为，在那里线型DNA片段可以通过简单的PCR阶段进行组装[29]。研究者已经获得了与Invitrogen公司的Gateway克隆技术兼容的根癌农杆菌质粒，例如，能超高通量产生一代Zymoseptoria tritici的过度表达菌株[30]。又如，通过酿酒酵母中的酵母重组技术或Golden Gate组装技术构建根癌农杆菌兼容载体，使得高通量载体构建获得了相应提高[12-14]。这些研究强调了一些重要技术挑战是如何被攻破的，另外，最近研究证明ATMT技术能够用于真菌高通量功能基因组分析[30]。更确切地说，在真菌功能基因组大数据时代，如果同时考虑ATMT转化技术的优缺点，那么该技术依旧是一个非常有用的技术并将继续在真菌研究中扮演重要角色。针对存在的问题和局限，笔者有以下4点建议：

首先，一个理想的插入突变方法应该有能力击中每一个基因，但是T-DNA对真菌基因组插入存在非随机插入模式。例如，新型隐球菌黑色素生物合成LAC1基因插入突变体分析研究表明，在 1 kb 启动子区域有5个T-DNA插入，而2.8 kb的编码区没有T-DNA插入，所以T-DNA对这个单基因的插入是非随机的[31-33]。又如，对数以万计的植物致病性子囊菌T-DNA插入突变体分析表明，T-DNA插入也存在偏好性，不是随机的。这也许是想要使用ATMT转化技术构建一个拥有每个基因都有T-DNA插入的突变体库的最大限制因素。尽管如此，T-DNA倾向于插入到基因外部的插入模式最近已经转变成了一个鉴定必需基因的有利条件[14]。如，在紧邻T-DNA的右边界克隆上GAL7基因的调节序列，并通过ATMT技术转入担子菌类新生隐球菌。转化和筛选都在含有半乳糖的介体中进行以确保插入位点附近的任何基因都能表达，然后在含有能抑制GAL7基因表达的葡萄糖的介体中对转化子进行生长测试。在葡萄糖存在的情况下，大约1%的转化子不能生长。分析T-DNA在新型隐球菌（Crypyococcus neoformans）基因组中的插入位点，表明这些位点位于子囊菌必需功能基因中。

其次，理想情况下，T-DNA的插入应包括完整的左右边界，随后获得的突变体若表现出有趣的性状，通过左右边界序列就可以快速鉴定出插入点附近的基因。鉴定这些被删除或破坏的基因可以通过交错式热不对称PCR（TAIL-PCR），反向PCR或其他的方法实现。然而，这种基因鉴定程序可能会遇到瓶颈，或者最终得到几种可能性结论。T-DNA 的不同插入方式可能为后续基因鉴定带来巨大挑战，例如，断裂式插入，携带超越左右边界的额外的质粒DNA片段插入，或者多拷贝串联插入，抑或多拷贝分散插入。插入也可能伴随着基因删除和基因组染色体重排。若T-DNA倾向于插入到基因间隔区，那么须要解决的问题是确定2个基因中的哪一个受插入的影响，有时对2个基因都进行qPCR试验可以鉴定出被影响的基因。大多情况下假设T-DNA的插入减弱了相邻基因的表达。然而，有些情况下，如在Leptosphaeria maculans菌中 T-DNA 的插入会加强相邻基因的表达[34]。

再者，对于有些物种，ATMT技术并不能比其他转化方法提供更多有价值的信息。对很多真菌来说，ATMT技术并不能使我们更了解基因功能。这包括在真菌上首次应用该转化技术的酿酒酵母[2]。这也是可以理解的，因为其他的转化技术可以应用到酿酒酵母上，可以使用化学诱变然后通过互补克隆基因，可以构建和使用含有删除所有基因的整套的基因缺失库，还可以利用基因组水平的资源。有这么多的技术可以分离突变体，鉴定被影响的基因，或表型筛选基因缺失库，所以使用ATMT技术作为另外一种转化方法几乎没有带来什么额外的益处。正如上面提到的，类似的情况也存在于丝状真菌模式物种粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），该真菌虽然是首次使用根癌农杆菌介导转化的丝状真菌物种之一[4]，但是此后再没使用该技术进行转化。第3个例子是关于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），该菌是揭示细胞周期调控机制的模式物种，而细胞周期调控机制曾是2001年诺贝尔生理学或医学奖的主題，事实上，这个菌及所在的外囊菌亚门的所有物种似乎都没有使用过ATMT技术进行转化。

最后，ATMT转化技术通常情况下是质粒将 T-DNA插入到基因组，然而在一些真菌中，例如转化玉米黑粉菌（Ustilago maydis）或曲霉菌属（Aspergillus spp.）使用含AMA1序列的质粒，那么质粒将会进行自主复制[35-36]。这些质粒可以容易地通过互补克隆被营救回大肠杆菌，也可以通过反向选择被蓄意丢失。

5 展望

ATMT转化技术是一种可以应用于植物和真菌分子生物学的工具，但是我们对转化寄主方面的了解甚少。例如，研究表明一组含129个拟南芥突变体库中的所有突变体对转化是有抵抗作用的[37]。然而，就分子工具和全基因组范围内可供研究的资源而言，真菌超过了其他所有的真核生物，因此可以作为理想的寄主用于研究真核细胞与细菌相互作用中寄主方面的角色。最近研究进展已经描述了T-DNA转移和插入过程[38]。选择真菌作为寄主能够洞察提高转化效率的方法以及T-DNA的插入机制。酿酒酵母突变体曾被用于鉴定那些影响转化效率的因素[39-44]，有一个发现是嘌呤浓度和生物合成也与植物上的转化效率有关[45]。因此，研究其他物种基因缺失库，例如，S. pombe或正在进行的N. crassa或C. neoformans研究项目，都是为了寻找抗转化菌株。在多个物种中探索转化需要的真核基因是因为不同的真菌存在明显的差别，如在C. neoformans中采用ATMT技术进行转化是不可能的，而在其他担子菌中则可以，又如酿酒酵母中嘌呤对转化效率的影响同时依赖于嘌呤合成基因以及酵母菌株[45]。如果这些信息可以借鉴到植物上用于解释为什么有的植物种类采用这种方法很难转化，那么这个研究方向将可能产生广泛影响。与转化相关的另一因素是根癌农杆菌本身，当前研究表明不同根癌农杆菌菌株转化效率不同。然而，很少有人在T-DNA插入偏好性以及基因靶向效应方面对菌株进行一一研究。

目前，鉴定T-DNA插入的基因依旧是个限速步骤。在鉴定插入基因方面，基因组测序比PCR或其他方法成本更高。实际上，下一代测序已经被应用于鉴定突变的基因。对L. maculans而言，识别插入基因很困难，对4个菌株分别进行测序以鉴别 T-DNA插入位点[46]。另一种方法被应用于C. neoformans突变体插入基因的鉴定，即对突变体DNA池同时测序，然后单个菌株中被影响的基因采用特异PCRs进行鉴定[47-48]。将来结合标签、条形码、非对称限制性内切酶及可利用的下一代测序能力，对插入基因的鉴定将变得更加容易。

植物中有許多报道称共转化可同时引入多种 T-DNA的插入[49]，然而在真菌中这个转化方法并不常见[50]。这种方法允许转化各自不同的 T-DNA 片段，与曾在真菌中应用的非常成功的双向的或split-marker的能增强靶标基因敲除的方法相似[29]。将来对其进一步改进可能会加强真菌中靶标基因敲除的能力[51-52]。

生物研究领域新兴的一个激动人心的研究技术是CRISPR/Cas基因编辑系统，正如ATMT技术在过去20年中的角色一样，这种技术将革命性地改变真菌生物学研究。如同应用于酿酒酵母的ATMT技术，行之有效的真菌CRISPR/Cas技术将很可能革命性地降低这些物种带来的挑战，特别是低拷贝物种中的基因敲除。值得提出的是，ATMT技术将依旧是许多真菌用于转化CRISPR/Cas结构的辅助工具。真菌中还没有开发的ATMT技术的另一个应用是瞬时转化。植物中有一种常规的方法可以引入CRISPR/Cas结构，如病毒侵染性克隆[53]，但是目前对真菌病毒操作困难，也许将来可以在真菌中使用类似的方法。也可以开发瞬时转化系统用于其他目的，如CRISPR/Cas，这就可以规避将 T-DNA 整合到基因组以及引起脱靶突变的可能。目前，已经通过使用不稳定的自主质粒将CRISPR/Cas系统成功地转入子囊菌和U. maydis的原生质体[54-56]。很显然，存在一种可能，即未来可以继续开发利用ATMT技术，但可能须要修改那些促使 T-DNA 插入真菌基因组的原件。

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