高效液相色谱法测定普洱熟茶中Puerins 401系列化合物的含量

2020-04-10陈丹丹许芮菁刘敏吴伯阳杨锐王鹏丁章贵高林瑞

中国茶叶加工 2020年1期

陈丹丹，许芮菁，刘敏，吴伯阳，杨锐，王鹏，丁章贵 *，高林瑞 *

（1.云南省普洱茶发酵工程研究中心，云南昆明 650217；2.云南大益微生物技术有限公司，云南昆明 650217）

普洱茶作为云南特有名茶，是由云南大叶种晒青毛茶制成的一种独特的微生物发酵茶[1]。在微生物发酵过程中，晒青毛茶中的多酚经氧化、甲基化、酰化、糖基化等作用形成大量多酚衍生物，如A环加成儿茶素类成分[2]。因此，微生物发酵茶具有降脂、降糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎、抗病毒等多种药理活性[3-4]。

研究表明，普洱茶素Ⅰ对高脂高糖喂养ApoE-/-小鼠的2型糖尿病并发高脂血症有治疗作用，证实其通过抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性和激活肝细胞低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达，从而降低空腹血糖和血浆总胆固醇含量[5]。8-N-乙基-2-吡咯烷酮取代黄烷-3-醇可下调衰老小鼠4-羟基壬烯醛和泛素化蛋白聚集体的形成及Aβ代谢途径，增加内源性抗氧化能力，减轻细胞缺氧，降低神经细胞凋亡率，有效保护SAMP8神经元[6]。

Puerins（普洱茶素）Ⅰ～Ⅷ是从普洱熟茶中分离得到的8种8-N-乙基-2-吡咯烷酮取代黄烷-3-醇[7]，结构见图1。Puerins 401系列化合物的相对分子量为401.15，分子式为C21H23NO7，含有3个手性碳原子，是微生物发酵茶特有的含氮多酚，由茶多酚与茶氨酸结合而成。其N-乙基-2-吡咯烷酮基团是由茶氨酸经Strecker降解转化为醛后自发环化产生，见图2[8]。课题组从微生物发酵茶中分离得到6个Puerins 401系列化合物，互为同分异构体，命名为 Puerins 401-1～401-6，结构式见图3。

图1 普洱茶素Ⅰ～Ⅷ分子结构式（R=H，OH）Fig.1 The molecular structures of PuerinsⅠ～Ⅷ (R=H，OH)

图2 N-乙基-2-吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇的形成过程（R=H，OH）Fig.2 The formation process of N-ethyl-2-pyrrolidinone substituted flavan-3-ols(R=H，OH)

图3 Puerins 401系列化合物结构式Fig.3 The structural formulas of Puerins 401 series compounds

目前国内外尚无Puerins 401系列化合物定量方法，为满足普洱熟茶特征活性成分质量控制需求，研究建立了HP 20大孔树脂自装柱净化富集提取液，高效液相色谱-紫外法（HPLC-UV）[9]测定普洱熟茶中6个Puerins 401化合物（401-1～401-6）含量，灵敏度高，准确性和重现性好。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2995 PDA （光电二极管列阵检测器，美国Waters公司），WD-9415B超声仪（北京六一仪器厂），H1850R低温离心机（湘仪离心机仪器有限公司），VORTEX 3旋涡混匀器（德国，IKA公司），R1001-LN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司），NAI-FXCQY-24固相萃取装置（上海那艾精密仪器有限公司），分析天平（精度0.0001 g，美国 OHAUS 公司）。

1.2 材料与试剂

SPE柱管（6 mL，PP材质，上海安谱实验科技股份有限公司）；小柱筛板（6 mL，PE材质，上海安谱实验科技股份有限公司）；HP 20大孔吸附树脂（日本三菱化学树脂株式会社）；定量滤纸（Φ12.5 cm，杭州双圈滤纸有限公司）；pH 试纸（pH 1～14，上海三爱思试剂有限公司）；针式过滤器（0.45 μm，尼龙66，天津津腾实验设备有限公司）。

乙腈、甲醇均为色谱纯（德国MERCK公司）；乙酸铵、甲酸（LC/MS，美国Fisher Scientific公司）；其他试剂未说明均为分析纯。

Puerins 401系列化合物对照品为实验室自行分离提纯制备获得，Puerins 401-1～401-6对照品纯度分别为 95%、90%、95%、85%、90%、95%。

1.3 色谱条件

Waters Atlantis dC18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为2 mmol/L乙酸铵水溶液（含1‰甲酸），B为乙腈。梯度洗脱程序：B相 0～10 min从 10%变化到 20%并保持 8 min，18～25 min从 20%变化到 90%，25～29 min从 90%变化到10%，并保持6 min；流速 1 mL/min；进样量为 10 μL，柱温35℃；紫外检测器：检测波长280 nm。

1.4 标准溶液的配制

分别称取一定量的Puerins 401系列化合物对照品，用甲醇溶解配制成如下浓度：Puerins 401-1～401-6 分别为 2.00、1.00、4.00、1.00、2.00、2.00 mg/mL的标准储备液，于-4℃避光保存。使用前，准确移取适量Puerins 401系列化合物标准储备液，用甲醇配置成如下浓度：Puerins 401-1～401-6 分别为 20～200、10～100、10～100、40～400、20～200、20～200 mg/L 的系列标准工作液，于-4 ℃避光保存[10]。

1.5 样品处理与富集

称取0.5 g（精确到0.0001 g）均匀研磨的茶样于15 mL离心管中，加入水10 mL，用旋涡混匀器均匀湿润，超声30 min，12000 r/min离心15 min，将上清液转移至125 mL分液漏斗中，残渣重复提取一次，合并上清液。在分液漏斗中加入60 mL二氯乙烷后左右震摇，弃去有机相，余下水相再用二氯乙烷重复萃取两次，将水相移入100 mL旋蒸瓶中，去除水中的有机相。之后，将水相用滤纸滤去残渣，待净化富集。

自装HP 20小柱（600 mg/6 mL），使用前用2～3倍柱体积的2%氢氧化钠溶液淋洗小柱，然后用水冲至pH=7，再用2～3倍柱体积的2%盐酸溶液淋洗小柱，之后用水冲至pH=7，后用乙醇完全置换柱内残留水并用乙醇浸泡小柱（过夜）。样品上柱前，用大量水完全置换乙醇。

将待净化富集的样品提取液分次移入已活化的HP20小柱。调节流速以1～2滴/s的速度通过柱子；待水相滤完，用10 mL 10%乙醇溶液淋洗小柱；负压抽干后，再用20 mL 50%乙醇溶液洗脱目标物，将洗脱液收集于50 mL旋蒸瓶中，于45℃水浴下旋蒸至干，用2 mL 50%甲醇溶液复溶，过0.45 μm有机相滤膜后，待测。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件优化

分别采用甲醇、乙腈作为有机相，纯水、1‰甲酸、2 mmol/L乙酸铵作为水相，等度洗脱、梯度洗脱作为洗脱程序，进行组合条件的优化。由于普洱熟茶的基质非常复杂，目标物附近有很多干扰峰，采用梯度洗脱才能达到最好的分离效果。最终，从峰形、干扰峰和目标峰的分离等结果表明，2 mmol/L乙酸铵水溶液（含1‰甲酸）-乙腈体系梯度洗脱的方法较优。

分别考察了不同色谱柱：Waters Xterra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC-C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Agilent XDB C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Atlantis T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Atlantis dC18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果发现 Waters Atlantis dC18色谱柱相较于其他色谱柱在同等条件下分离效果最佳，6个同分异构体均可出峰，其保留时间和半峰宽[11]见表 1，分离度依次为 3.45、1.82、0.95、3.59、2.30。

表1 Puerins 401系列化合物各组份的保留时间和半峰宽Table 1 The retention time and half-peak width of each Puerins 401 series compound

2.2 富集净化步骤开发

普洱熟茶成分复杂，基质效应显著，会明显影响方法的灵敏度。固相萃取法是最常用的样品前处理方法[12]。

首先研究不同类型商品柱对Puerins 401系列化合物的富集净化效果，结果表明所使用商品柱不适宜普洱熟茶中此类化合物的测定。后考察5种大孔树脂对净化富集样品提取物的适用性[13]。首先，混标溶液通过装满一种材料的净化柱来评估所有待测材料的回收性能。其中，HP20树脂回收率在80%～90%之间，满足净化柱要求。然后，比较了每种吸附材料对普洱熟茶中Puerins 401系列化合物富集洗脱效果，HP20树脂中Puerins 401系列化合物集中于30%～50%乙醇水洗液，其他材料目标成分分散梯度宽。净化柱研制完成后，优化洗脱梯度，结果为10%乙醇水溶液为淋洗液，50%乙醇水溶液为洗脱液。按“1.5”所述进行样品处理与富集[14]。

2.3 方法线性范围与相关系数

实验采用外标法定量，在优化条件下检测Puerins 401系列化合物对照品，以其峰面积为纵坐标（y轴），其浓度为横坐标（x轴）做标准曲线[11]。结果表明，Puerins 401系列化合物各组份在2.0～500.0 mg/L范围内具有良好的线性，所得到各组份的线性方程、相关系数[11]见表2。Puerins 401系列各化合物的检出限（LOD）[15]为3.6～5.9 mg/kg。由于检出限一般表示为3倍信噪比（S/N），而定量限一般表示为10倍信噪比（S/N），即定量限可以表示为3.3倍检出限，所以为Puerins 401系列各化合物的定量限（LOQ）[16]为 11.9～19.5 mg/kg。

表2 Puerins 401系列化合物各组份的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 The linear equation,correlation coefficient,detection and quantitative limit of each Puerins 401 series compound

2.4 仪器精密度、方法重现性及加标回收率

取上述Puerins 401系列化合物对照品于上述测定条件下，重复进样6次，进样量10 μL，以Puerins 401系列化合物峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）为 0.62%～1.07%（n=6），如表 3所示。

根据“1.5”进行同一样品6次平行实验，每个平行样品进样1次，进样量10 μL，以各Puerins 401系列化合物含量，计算其相对标准偏差（RSD）为 1.80%～4.81%（n=6），如表 3所示。

取已知浓度样品进行浓度为0.2 g/kg的Puerins 401系列化合物加标回收率实验，结果为75.0%～99.5%，如表4所示。Puerins 401系列化合物对照品色谱图见图4，样品色谱图见图5。

表3 Puerins 401系列对照品及样品中各组分相对标准偏差（RSD%）（n=6）Table 3 Relative standard deviation(RSD%)of each Puerins 401 series compound in the same reference substance and the same sample

表4 Puerins 401系列化合物加标回收率Table 4 The spiked recovery of each Puerins 401 series compound

图4 Puerins 401系列化合物对照品色谱图Fig.4 The chromatogram of Puerins 401 series compound

图5 普洱熟茶样品色谱图Fig.5 The chromatogram of Pu-erh Tea sample

3 实际样品测定

从茶叶市场上采购17个普洱熟茶样品，进行Puerins 401系列化合物的测定，其结果如表5所示，不同品类普洱熟茶中Puerins 401系列化合物含量有所差别。在这17个普洱熟茶样品中，Puerins 401-1～401-6 的含量分别在 41.1～169.7、36.6 ～163.5、172.1 ～375.3、7.8 ～59.7、126.5 ～342.8、249.9～827.1 mg/kg之间，Puerins 401 系列化合物总量在655.2～1806.1 mg/kg之间。