血清抗体ELISA检测阴性的抗肾小球基底膜病1例

郝雨 秦伟

610041 成都，四川大学华西医院肾内科

病 例 资 料

患者，男，38岁，因“痰中带血1个月”于2018年7月12日入院。入院前1个月，患者无明显诱因出现暗红色血痰，量少，咳 2～3口，不伴有发热、胸闷、气紧，于2018年6月7日到广元市人民医院门诊就诊，查胸部CT示双肺多发渗出灶，未予以处理。此后患者未再出现痰中带血，无明显不适症状，为诊治肺部病变遂来我院。患者有慢性乙型肝炎病史，否认高血压、糖尿病、呼吸系统疾病、泌尿系统疾病病史，否认吸烟、特殊药物、毒物接触史。入院查体：T：36.3℃，P：116次/分，R：20次/分，BP：115/90 mmHg。神志清楚，全身浅表淋巴结未触及，心肺腹体检未见异常，双下肢无水肿。诊治经过：2018年7月12日查胸部CT：双肺弥漫分布磨玻璃密度片影，肺门及纵隔淋巴结无肿大(图1)。行电子纤支镜检查：各级支气管管腔未见异常，肺泡灌洗液病理送检未见异常。查血常规：血红蛋白104 g/L。生化：白蛋白40.7 g/L，血肌酐(Scr)71 μmol/L。肝功能、血糖、凝血功能、结核抗体、降钙素原、真菌G+GM试验、肺癌标志物、巨细胞病毒、EB病毒、肺炎支原体+衣原体抗体、抗中性粒细胞浆抗体、抗GBM抗体、免疫球蛋白、ANA抗体谱、补体C3、补体C4均未见异常。乙肝抗原阳性，HBV-DNA定量8.95×102IU/mL，丙肝抗体、梅毒抗体、HIV抗体均阴性。查尿常规：尿隐血(+++)，尿蛋白(+++)，尿红细胞144/HP。24 h尿蛋白定量7.4 g/d。泌尿系彩超：双肾大小、形态未见异常，双肾实质回声增强，考虑患者同时存在肺部、肾脏疾病，二者可能存在相关性，于7月24日行右肾穿刺活检术，术后病理：光镜：肾小球总数15～17个；肾小囊：细胞性新月体2个；系膜：节段细胞及基质轻度增生；基膜：节段空泡变性；毛细血管腔：4个小球节段坏死。肾小管：小管上皮细胞中度变性；肾间质、血管病变不明显。免疫荧光：IgG、C3、κ、λ：7个小球基膜线状沉积，IgA、IgM、C1q：7个小球阴性(图2)。患者肾脏病理示肾小球以节段坏死及新月体形成病变为主，免疫荧光IgG、C3成线状沉积，病理诊断为抗肾小球基底膜(GBM)病。患者肺部病变则考虑为抗GBM抗体引起的弥漫性肺泡出血。治疗上予以双膜血浆置换7次，泼尼松50 mg口服 qd，环磷酰胺50 mg 口服bid，缬沙坦降尿蛋白，恩替卡韦抗乙肝病毒等对症支持治疗。2018年8月6日复查生化：白蛋白26.7 g/L，Scr 85 μmol/L。24 h尿蛋白定量6.8 g/d。复查胸部CT示：双肺磨玻璃样病变较前明显吸收(图1)。患者出院后继续规律服用上述药物治疗。2018年9月25日复查生化：白蛋白39.8 g/L，Scr 89 μmol/L，24 h尿蛋白定量13 g/d，尿常规：尿隐血(+++)，尿蛋白(+++)，尿红细胞44/HP。抗中性粒细胞浆抗体、抗GBM抗体阴性，HBV-DNA定量阴性。再次收入院，予以甲泼尼龙500 mg连续静滴3 d，环磷酰胺 1g 静滴冲击治疗，嘱患者出院后继续服用泼尼松45 mg、每日一次后泼尼松逐渐减量，每2周减5 mg，直至10 mg、每日一次维持治疗。10月30日予以环磷酰胺静滴1 g冲击治疗，累积剂量8 g后停用。自11月27日开始服用他克莫司小剂量起始，后调整为1 mg口服、每日两次。2019年4月30日复查生化：白蛋白40.8 g/L，Scr 81 μmol/L，24 h尿蛋白定量3.22 g/d，抗GBM抗体阴性。

讨 论

抗GBM病是抗肾小球基底膜抗体介导的器官特异性自身免疫性疾病。抗GBM抗体的靶抗原位于Ⅳ型胶原α-3链羧基末端非胶原结构域(non-collagenous domainC1，NC1)即α3(Ⅳ)NC1，含两个主要的隐匿性抗原表位EA和EB[1- 2]，而Ⅵ型胶原α-3链限制表达于肾脏、肺脏、耳蜗、睾丸组织的基底膜及眼Bruch膜[3]。在各种诱发因素作用下，抗原表位暴露刺激产生抗GBM抗体。抗体作用于肾小球基底膜，导致局灶节段性纤维素样坏死，常进展形成大量新月体，快速进展至肾衰竭；作用于肺泡基底膜，导致肺泡壁断裂纤维化引起弥漫性肺出血，严重者发生大咯血威胁生命[4]。免疫荧光检测可见免疫球蛋白IgG沿肾小球基底膜、肺泡壁基底膜成线性沉积。根据抗GBM病的定义，需同时具备：(1)肾小球肾炎或(和)肺出血；(2)血清抗 GBM 抗体阳性。然而，尽管十分少见，临床上少部分组织病理证实为抗GBM病的患者，其血清中却未能检测出抗GBM抗体[5-9]。本文报道1例血清抗体酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测阴性的抗GBM病病例，并进行文献回顾，分析血清抗体阴性的原因及加深对该病的认识。

抗GBM病病情险恶，早期快速诊断对挽救患者生命、摆脱透析治疗十分关键。临床上，通常采用商业化的ELISA试剂盒定量检测患者血清中的抗GBM抗体，进行快速诊断和监测治疗效果。Sinico等[10]研究人员曾比较了4种抗GBM抗体ELISA试剂盒的产品性能，发现均具有良好的灵敏度，高达94.7%～100.0%，但特异性有所差异，最低90.9%，最高达100%。然而，已有多篇文献报道在少数抗GBM病患者血清中，商业化的ELISA试剂盒并未能检测到致病性的抗GBM抗体，分析可能原因：(1)ELISA检测方法本身的局限性。用灵敏度更高的Western blotting替代ELISA方法可提高抗GBM病患者血清抗体的阳性检出率。有文献报道，使用ELISA和Western blotting两种方法均未检测出血清抗体的抗GBM病患者，利用biosensor技术却能够检测出其血清致病抗体[6]。但是Western blotting和biosensor技术均难以在临床工作中开展。(2)抗GBM抗体通常为免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)。IgG1亚类是主要的致病抗体[11]。而文献报道一些抗GBM病患者其致病抗体为IgG4亚类[7]。临床使用的商业化ELISA试剂盒是用于检测抗GBM 的IgG型抗体，但对IgG4亚类不敏感。还有文献报道一些患者的抗GBM抗体可为IgA型[12]，用商业化的ELISA试剂盒则检测不出。(3)抗GBM抗体的靶抗原位于IV型胶原上。IV型胶原由6条不同的α链组成(α-1～α-6)，α(IV)链包括3个主要结构域：NH2-末端7S结构域、胶原域和羧基末端非胶原结构域(non-collagenous domain C1，NC1)，3条链通过NC1之间的相互作用形成3种异源三聚体：α1α1α2、α3α4α5和α5α5α6，成熟GBM中只含α3α4α5[13-14]。通常认为抗GBM抗体的靶抗原位于α3(IV)NC1，含两个主要的隐匿性抗原表位EA和EB。研究发现一些患者的抗GBM抗体并未作用于α-3链的EA和EB表位，可能通过识别α3α4α5(V)构象型表位而致病[15]。还有一些研究报道抗GBM抗体靶抗原可能并未在α-3链上，而位于α5(IV)NC1或α4(IV)NC1[16]。商业化的ELISA试剂盒其微孔板包被的抗原是高度纯化的IV型胶原α-3链，检测不出上述特殊类型的抗GBM抗体。

本文报道的病例，多次使用商业化ELISA试剂盒检测患者血清抗GBM抗体均为阴性，原因存在上述多种可能性，同时该患者的临床表现以肾病范围的大量蛋白尿为主，肾功能在正常范围内，在抗GBM病中并不常见。需考虑是否合并有膜性肾病、微小肾病、膜增生性肾小球肾炎、糖尿病肾病、乙肝相关肾病、单克隆免疫球蛋白相关肾病等可引起大量蛋白尿的肾脏疾病。该患者虽有乙肝病史，但其肾脏组织病理示光镜下少部分肾小球毛细血管的节段坏死，小细胞新月体形成，免疫荧光为典型的IgG、C3沿GBM线性沉积，无其他部位免疫球蛋白的沉积。电镜观察肾小球足细胞可见节段足突融合，未见其他异常(图3)，符合典型的抗GBM病病理特点，并不存在合并其他肾病的病理特征，最终诊断为抗GBM病。经典的抗GBM病需要血浆置换联合强的松加环磷酰胺免疫抑制治疗来挽救肾功能或控制大咯血，而对于肾功能正常的抗GBM病患者尚没有统一的指南和共识指导治疗。少量的临床观察研究显示，此类患者经过积极的血浆置换和免疫抑制治疗，能长期维持正常的肾功能[17-19]。本病例难以检测患者血清抗GBM抗体滴度，难以评估血浆置换的治疗剂量和效果；予以糖皮质激素加环磷酰胺药物治疗，患者的肾功能维持在正常范围，但蛋白尿无明显缓解；改为小剂量泼尼松+他克莫司治疗后，尿蛋白较前明显下降，继续门诊随访观察病情变化。目前，商业化的ELISA试剂盒已广泛应用于临床以快速检测患者血清的抗GBM抗体。但由于检测方法的局限性，阴性结果并不能完全排除抗GBM病。该病例提醒我们需结合患者的临床特征、血清学、组织病理检查结果进行综合分析，组织病理仍是明确抗GBM病诊断的金标准。