辽宁绒山羊绒肉兼用品系ZBED6基因克隆、分子特征分析

赵艳娇 李丰田 张晓鹰 郭丹 白文林

摘 要 本研究以辽宁绒山羊为研究对象，利用分子生物学技术，克隆ZBED6基因进行序列测定，分析基因的5′调控区、编码区。借助生物信息学分析软件，将辽宁绒山羊ZBED6基因与其他物种基因序列进行比对，并预测其CpG岛，为辽宁绒山羊的分子育种研究奠定理论基础。

关键词 ZBED6基因；克隆；辽宁绒山羊

辽宁绒山羊原产于辽宁省东南部山区是我国绒山羊品种中产绒量最高的优良品种，属绒肉兼用型品种。辽宁省畜牧科学研究院新培育的辽宁绒山羊“绒肉兼用”新品系种羊具有体格高大，遗传性能稳定，生长速度快等优势。随着生物技术的发展，对参与肌肉生长发育过程基因的研究也越来越深入。锌指蛋白（ZBED）是IGF2基因的内含子3突变区域中存在的一个抑制因子，大量研究表明，ZBED作为转录因子在哺乳动物的生长发育甚至是细胞的增殖分化的过程中有重要的调节作用[3]。本文从分子生物学的角度阐述了ZBED6对辽宁绒山羊肌肉生长发育的调节，为辽宁绒山羊“绒肉兼用”品系分子育种工作提供理论依据。

1 试验材料

1.1 试验动物

本实验所采用的实验动物均来自于辽宁省现代农业生产基地建设工程中心畜牧业部的健康辽宁绒山羊，选取成年公羊13只。

1.2 试验药品

DEPC、DNA聚合酶、MgCl2（25mM）、10×TAE、6×DNA Loading Buffer、引物等均采自上海生工生物有限公司；DM2000 Marker、RT-PCR反转录试剂、TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、总RNA提取试剂盒采自大连TaKaRa生物有限公司；氯仿、无乙水醇、异丙醇1、丙三醇等采自国药集团化学试剂有限公司；去离子水为实验室提供。

2 试验方法

2.1 总RNA的提取

对辽宁绒山羊的七种不同组织的总RNA的提取，采用TRIzol法对总RNA进行提取，提取后的RNA的浓度和纯度使用Thermo Scientific核酸测定仪和琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.2 总RNA的反转录反应

用PrimeScrimeTM RT Reagent Kit（TaKaRa，大连）反转录成cDNA，，第一步先去除样品中残留的基因组RNA反应，完成后将离心管取出，继续进行反转录试验，PCR仪设置成：37℃，15min；85℃，5s；4℃。将配制好的共40μl的反应液，充分混匀后放置于PCR仪内进行反应，反应完成后将合成的cDNA于-20℃冷冻保存备用。

2.3 PCR反应

设计特异性引物对辽宁绒山羊的IGF2基因5′调控区和编码区进行扩增，再进行反转录的cDNA，建立25μlPCR反应体系进行扩增。扩增后的产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并将扩增产物送至生物公司进行测序。

3 结果与分析

3.1 ZBED6突变位点及位置

经过分析发现，通过特异性设计引物扩增出辽宁绒山羊的ZBED6基因序列长度为4851bp，包括5′调控区、编码区，编码区长度为2943bp。将克隆出的辽宁绒山羊序列与山羊的序列进行对比发现，第838bp处发生A/G突变；第944bp处发生A/G突变；第1799bp处发生C/T突变；2276bp处发生A/G突变；2323bp处发生C/T突变；2333bp处发生G/T突变；2397bp处发生A/G突变；2480bp处发生A/G突变。

3.2 不同物种的ZBED6基因分子进化关系

将克隆出的辽宁绒山羊的ZBED6序列与其他动物的ZBED6序列进行对比分析，辽宁绒山羊与和山羊的同源性高达99.8%，与其它物种相比，ZBED6的同源性分别是：绵羊99%，藏羚羊99%，牦牛98%，水牛98%，猪91%，马90%。通过以上动物之间的比对发现，ZBED6作为调控肌肉生长发育的基因在部分偶蹄目动物和奇蹄目动物中不仅是在物种内高度保守，在种间也同样高度保守，在进化过程中趋于稳定。

3.3 ZBED6蛋白质结构和生物信息学特征

对辽宁绒山羊ZBED6编码区总长度进行开放阅读框的分析，遵循Kozak法则（起始密码子为ATG结构），通过软件分析发现，根据软件预测，其体外半衰期为30小时，不稳定系数为50.72（该值大于40为不稳定蛋白），脂肪族氨基酸指数为83.06，其蛋白质氨基酸残基亲疏水性总和为-0.281，说明辽宁绒山羊ZBED6的编码蛋白质疏水性较弱且不稳定。

4 讨论

ZBED6作为一种调控基因其特点主要是IGF2的抑制因子，通过生物学信息分析发现，其mRNA有较高的化学能，作为一种抑制因子，该特点使基因有较高的稳定性，通过保守区和二级结构的预测发现其具有较高的保守性。随着基因的分子进化，构成蛋白质序列的所有氨基酸的种类并不是共同进化的，一些重要的氨基酸序列依然是具有非常高的保守性，这就导致了在蛋白质家族成员中有一些相同的核心的保守区，所以可以通过对保守区的对比，推测某种未知蛋白的潜在功能。

5 小结

（1）辽宁绒山羊ZBED6的基因编码区，发现ZBED6基因编码区序列总长度为2943bp，编码980个氨基酸。克隆出的序列中，第838bp处发生A/G突变；第944bp处发生A/G突变；第1799bp处发生C/T突变；2276bp处发生A/G突变；2323bp处发生C/C突变；2333bp处发生G/G突变；2397bp处发生A/A突变；2480bp處发生A/G突变。（2）通过不同物种之间的亲缘关系进化树分析发现ZBED6基因在物种之间是比较保守的，不同目之间的也有80%以上的相似度。（3）对ZBED6的启动子序列和CpG岛进行预测，发现ZBED6有三个TATA-box，四个CpG岛，并对预测其mRNA的二级结构的化学性质。（4）利用软件对ZBED6的信号肽和蛋白质亲水性进行分析发现，ZBED6没有信号肽序列，两者均是亲水性蛋白质。（5）ZBED6编码980个氨基酸，相对分子质量是109518.38，对其二级结构和结构域进行预测发现其固定的结构域具有高度保守的特点，并预测其三维结构。

参考文献

[1]姜怀志等.辽宁绒山羊的若干种质特性[ J]，中国草食动物，2011.（06）：72-75.

[2]孙亚波等. 辽宁绒山羊羔羊肉用性能和羊肉品质研究[ J].现代畜牧兽医，2014.（09）：14-18.

作者简介：赵艳娇（1979-），女，汉族，硕士，高级畜牧师，研究方向：绒山羊育种管理。

通讯作者简介：郭丹（1981-），女，汉族，硕士，研究员级高级畜牧师，研究方向：绒山羊育种。

基金项目：国家绒毛用羊产业技术体系饲料资源开发岗位（CARS-39-10）、农业科技攻关项目（2017202005）