西维来司钠对创伤失血性休克复苏后大鼠的保护作用及可能机制▲

王 艳 宗 媛 牛 丹 董道然 王会东

(1 陕西省人民医院重症医学科，西安市 710068，电子邮箱annie1999@qq.com；2 陕西省西安市第一医院麻醉科，西安市 710002)

创伤失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)是临床上常见的具有高死亡率的疾病，仍是重症医学领域急需攻克的难题之一。THS的病理生理变化是由创伤及失血造成机体有效循环血量减少、微循环障碍、细胞氧代谢紊乱、凝血障碍及继发性器官功能损害引起[1]。其中，中性粒细胞直接参与形成毛细血管“无复流”现象、失控的“瀑布样”级联性炎性反应、凝血功能障碍，以及细胞氧代谢失衡[1]。中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) 是中性粒细胞释放的一种蛋白酶，在机体炎性反应的病理过程中起到重要作用，中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(neutrophil elastase inhibitor，NEI)已被证实可通过对弹性蛋白酶的选择性抑制作用，在急性呼吸窘迫综合征、急性胰腺炎、创伤性脑病、心肌缺血再灌注损伤、脓毒症、爆震伤等疾病中起到保护作用[2-7]。本研究观察NEI西维来司钠对THS大鼠复苏后器官功能及炎性因子水平的影响，探讨其对THS个体的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级、健康、雄性成年SD大鼠30只[原第四军医大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(军)2012-0007]，8～10周，体重 250～300 g。饲养于温度20℃～25℃，相对湿度55%～65%，阴暗、安静环境中，12 h白昼交替，常规喂养，自由摄食进水。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组(sham 组)、THS模型组、西维来司钠处理组(S组)，每组10只。

1.2 主要药品、试剂及设备 10%水合氯醛购自国药集团试剂有限公司(批号：20170912)，西维来司钠购自上海汇伦生命科技有限公司(批号：HLA0048)，大鼠肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)购自上海西唐生物有限公司(货号：F16960)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)酶联免疫吸附 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒均购自上海西唐生物有限公司(货号：F15870、F15640)。SpectraMax M5酶标仪购自美国Molecular Devices公司，RM-6200型智能多导生理监护仪相连购自成都仪器厂，PowerLab 生物信号采集处理系统购自澳大利亚ADInstruments 公司， COBAS Integra 400 Plus全自动生化检测仪购自瑞士罗氏公司 。

1.3 THS复苏后大鼠模型的建立及干预方法 参照文献[8]建立THS复苏后大鼠模型。各组大鼠适应性喂养1周后，术前禁食过夜，自由摄水。10%水合氯醛(3.5 mL /kg，腹腔注射)麻醉各组大鼠后，腹正中行5 cm切口造成软组织创伤后进行缝合。双侧股动脉插入聚乙烯导管(美国BD公司，24 G，批号：80430022)以监测血压同时进行放血，右股静脉插入聚乙烯导管备用以进行液体复苏，以上导管均通过皮下隧道埋置于背部皮下。除sham组外，其他两组在10 min内迅速放血使平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)降至35～40 mmHg，若血压不能维持则需要补充最大放血量 40%的林格氏液，以维持MAP在35～40 mmHg之间至出血90 min后，使用4倍最大放血容量的林格氏液进行复苏60 min。复苏后拔除所有插管、缝合所有伤口。术后各组大鼠自由进食饮水。S组在复苏前即刻一次性给予腹腔注射200 mg/kg西维来司钠，THS组在复苏前即刻一次性腹腔注射等体积的生理盐水。

1.4 观察指标 (1)血流动力学及心功能指标： 记录复苏后即刻各组大鼠的MAP、心率。复苏后24 h，各组大鼠经再次麻醉后分离右颈总动脉并置管于左心室，监测左心室压力最大上升速率(maximum of positive first derivative of left ventricular pressure,+dp/dtmax)和左心室压力最大下降速率(maximum of negative first derivative of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。(2)血气分析：复苏后24 h采集各组大鼠动脉血1 mL，行动脉血气分析检测乳酸、pH、PaO2、PaCO2、HCO3-水平。(3)肝肾功能：复苏后24 h各组大鼠取静脉血2 mL静置30 min 后离心(4℃,3 000 r/min，20 min)，取上清液制备血清，放入全自动生化检测仪检测AST、ALT、尿素氮及肌酐水平。(4)炎症指标：取各组大鼠(3)中的上清液，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、HMGB1水平，按照试剂盒说明书进行操作。Sham组大鼠记录其他组大鼠复苏时的即刻MAP、心率；(1)～(4)中的其余指标在完成导管置入术后24 h进行检测，操作同上。

1.4.5 肺系数及肺湿/干重比：复苏后24 h开胸取全肺称重，计算肺系数，肺系数=肺质量/体质量×100%。取右肺下叶，称湿重，然后置75°C 烤箱干燥，计算肺湿/干重比(ratio of wet weight to dry weight,W/D)，W/D=湿重/干重。

1.4.6 组织病理学观察：复苏后24 h取各组大鼠心、肺、肝、肾组织，磷酸缓冲盐溶液清洗干净后迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后，逐级酒精脱水，置二甲苯透明，浸蜡、石蜡包埋，切片，脱蜡，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色，树胶封固，置于光镜下观察组织形态学变化。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠复苏后血流动力学及心功能比较 复苏后即刻，S组及THS组心率、MAP均较sham组下降(均P<0.05)，但S组及THS组间差异无统计学意义(均P>0.05)。复苏24 h后，S组和THS组的+dp/dtmax及-dp/dtmax均低于sham组(均P<0.05)，而S组的+dp/dtmax及-dp/dtmax均高于THS组(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠复苏后血流动力学及心功能比较(x±s)

2.2 3组大鼠复苏后24 h动脉血气指标及肺系数、W/D比较 复苏后24 h，与sham组比较，其他两组的pH、PaO2、HCO3ˉ均降低，而PaCO2、乳酸、W/D及肺系数均升高(均P<0.05)；但与THS组比较，S组的pH、PaO2、HCO3ˉ均升高，而PaCO2、乳酸、W/D及肺系数均降低(均P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠复苏后24 h动脉血气指标及肺系数、W/D比较(x±s)

2.3 3组大鼠复苏后24 h肝、肾功能指标比较 复苏后24 h，与sham组比较，其他两组ALT、AST、尿素氮、肌酐水平均升高，但S组上述指标均低于THS组(均P<0.05)，见表3。

表3 3组大鼠复苏后24 h肝肾功能指标比较(x±s)

2.4 3组大鼠复苏后24 h心、肺、肝、肾形态学改变 (1)心肌：sham组光镜下可见心肌细胞排列整齐，未见明显水肿及炎性细胞浸润；THS组可见心肌细胞水肿，心肌纤维紊乱，毛细血管充血，有核细胞浸润增多；而S组可见心肌细胞走形基本整齐，仍有轻微水肿，肌间隙有核细胞浸润情况较THS组明显减少。(2)肝脏：sham 组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，呈放射状，肝窦间隙正常；THS组可见肝小叶结构破坏，肝窦扩张伴淤血，肝细胞肿胀，并伴有不同程度的点状坏死，胞核浓缩；而S组损伤较THS组轻微，肝小叶结构尚完整，肝细胞水肿减轻，变形坏死少见，肝窦扩张轻微，其间淤血不明显。(3)肺脏：sham组大鼠肺泡形态正常，肺泡壁完整； THS组可见肺泡壁完整性破坏，肺泡腔内有大量炎性细胞浸润渗出及片状出血，肺毛细血管充血；S组肺毛细血管充血、出血均较THS组明显减轻，肺泡腔内炎细胞浸润减少。(4)肾组织： sham组肾单位结构完整；THS组的肾小管上皮细胞及间质水肿，部分肾小管可见细胞管型；S组上述表现减轻。见图1。

sham组 THS组 S组

2.5 3组大鼠复苏后24 h炎症因子及HMGB1水平比较 THS组与S组血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均高于sham组，而S组以上指标水平均低于THS组(均P<0.05)，见表4。

表4 3组大鼠复苏后24 h炎症因子及HMGB1水平比较(x±s)

3 讨 论

THS具有高发病率、高死亡率的特点。尽管经过损伤控制及液体复苏后，仍有近30%的THS患者因合并多脏器功能障碍综合征而死亡[9-10]。炎症反应在THS中具有重要作用，贯穿在THS的整个病理生理过程：首先，创伤后中性粒细胞通过与内皮细胞相互作用损伤血管内皮细胞，增加血管通透性，并穿越内皮向缺血组织聚集，堵塞毛细血管，加剧血流动力学紊乱及组织细胞缺血、缺氧；其次，再灌注后中性粒细胞与内皮细胞黏附增加，刺激促炎细胞因子的产生和释放，并促进大量活性氧、自由基释放造成氧化应激损伤。内源性蛋白酶抑制剂在活性氧作用下失活，导致蛋白酶及其抑制剂失衡，产生“瀑布样”级联放大炎症效应，诱导全身炎症反应综合征。机体这种不断自我放大的失控炎症反应，在创伤后的感染因素作用下直接导致脓毒症，甚至诱导多脏器功能衰竭，使病死率大幅度提升[1]。TNF-α是炎症早期的促炎反应因子，能激活内皮产生IL-6、IL-8等炎症因子；同时通过抑制纤溶系统活性，导致微血管舒缩异常及微血栓形成，加重凝血功能障碍[7]。HMGB1是晚期促炎细胞因子，能够进一步放大炎症反应。本研究结果显示，建模后大鼠的心率、MAP、+dp/dtmax及-dp/dtmax下降，pH、HCO3ˉ均降低，而乳酸、W/D、肺系数、肝肾功能指标均升高(均P<0.05)，即大鼠出现了心脏收缩功能下降、肺水肿、乳酸堆积、肝肾功能损伤，提示成功建立模型。而复苏后的THS大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1仍高于sham组(P<0.05)，提示HMGB1作为促炎细胞因子，在THS发挥了重要作用。

NE是活化中性粒细胞释放的一种酶，过度释放的NE会破坏器官富有弹性蛋白的结缔组织。内源性NEI与NE之间的动态平衡为机体提供保护屏障。西维来司钠是目前唯一上市的人NEI，主要用于治疗急性肺损伤。越来越多的实验表明，西维来司钠在肺外其他疾病中，如心肺流转术后炎症反应、创伤后膝关节骨性关节炎、脓毒症相关肺及肾损伤、缺血再灌注损伤等，也发挥重要保护作用[3，6，11-14]。研究结果显示，创伤活化中性粒细胞能够阻止内源性NEI对NE的抑制作用，引起两者之间的平衡失调；创伤后NE水平明显升高，诱导血管内皮损伤，组织通透性增强，组织水肿增加；NE促进机体内凝血因子形成，诱发凝血功能障碍，同时促进炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α等大量释放，趋化中性粒细胞渗出血管并向炎症部位集中，加重细胞膜的损伤[7，15-16]。本研究结果表明，给予外源性西维来司钠后， S组的TNF-α、IL-6、HMGB1水平较THS组分别下降29.51%、36.32%以及34.46%(均P<0.05)，提示西维来司钠可以通过抑制NE从而抑制THS后过度释放的炎性因子。既往实验结果显示，西维来司钠可有效抑制NE、拮抗中性粒细胞的组织浸润及聚集，减少 TNF-α、IL-6、HMGB1上调，减轻炎症反应，治疗性地逆转组织水肿、炎性渗出，从而改善器官功能[6，13-14]。本研究结果也显示，与THS组比较， S组大鼠心功能指标、血气指标、W/D及肺系数、肝肾功能指标均有所改善，心、肺、肝、肾组织水肿均有所减轻(均P<0.05)，这可能是因为西维来司钠能够通过有效地降低对周围蛋白质降解和破坏，从而减轻组织水肿及炎性渗出，改善血管充血、出血，减轻细胞坏死，进而改善脏器功能。

综上所述，西维来司钠能够改善THS复苏后大鼠的心肝肾等脏器功能以及动脉血气分析指标，减轻肺损伤及损伤后乳酸堆积，其具体机制可能与其特异性抑制NE活性、减少损伤后组织炎性细胞浸润及炎性因子过度释放有关。