肝细胞肝癌的IVIM-DWI 多定量参数与病理的相关性研究

郭瑞 邓得峰 吴英 李金芳 马静

肝细胞肝癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一[1]。 WHO 国际癌症中心统计显示，全世界每年新增超过70 万HCC 病例，HCC 是全球癌症死亡的第二大原因，在中国患HCC的病人占全球新发和死亡病例总数的50%[2-3]。 HCC为富血供、多中心发生，具有侵袭性，易发生肝内扩散和肝外转移，预后较差[4]。基于扩散加权成像（DWI）的体素内不相干运动 （incoherent motion in voxel，IVIM）成像是一种功能性、非增强的MR 成像技术，可以相对定量地评估肿瘤扩散和灌注信息， 显示肿瘤组织微结构和微循环的变化， 已广泛用于评价肿瘤微环境，尤其对于检测肝脏恶性病变、转移以及疗效监测具有显著优势[5]。 CD34-微血管密度（CD34-microvascular density，CD34-MVD）、α-平滑肌激动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）分别作为HCC血管内皮细胞和癌相关成纤维细胞的主要标志物，可以反映恶性肿瘤的侵袭性生物学行为，促进肿瘤细胞增殖，与HCC 的血管生成、微循环变化有密切关系[6]，因此本研究重点分析α-SMA、CD34-MVD与IVIM-DWI 多定量参数的相关性，以探究术前可以反映α-SMA、CD34-MVD 的相关影像参数，为HCC 病人提供潜在的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象 前瞻性收集2017 年8 月—2018 年9 月间新疆生产建设兵团医院的肝病病人67 例，最终纳入HCC 病人30 例，其中男17 例，女13 例，年龄41～79 岁，平均（56.13±7.45）岁。 纳入标准：①患有慢性肝病；②肝结节未经介入、放化疗等治疗；③均行腹部常规MRI 及IVIM-DWI 序列扫描且临床资料完整；④影像清晰，病灶显示佳；⑤经病理证实为HCC。 排除标准： ①大量腹水（3 000~4 000 mL）；②身体不能耐受检查；③伴有其他系统肿瘤。本研究通过医院伦理委员会批准， 所有病人于检查前签署知情同意书。

1.2 设备及参数 病人检查前空腹8～12 h。 采用GE Discovery 750 3.0 T MR 设备，腹部8 通道相控阵线圈，呼吸触发，病人取仰卧位，足先进，扫描范围从膈顶上部约2 cm 处到肾脏下端。扫描序列包括呼吸门控横断面抑脂T2WI、呼吸门控冠状面T2WI、呼吸门控横断面T2WI、多b 值IVIM 成像、呼吸门控横断面T1WI，各序列相应参数见表1，其中多b 值IVIM成像采用自由呼吸触发扫描，b 值分别为0、10、20、50、100、150、200、400、600、800、1 000 s/mm2，平均扫描时间（3.57±6.89）min。

1.3 影像分析 采用GE ADW4.6 工作站Functool-MADC 软件对图像进行后处理， 获得相关参数包括表观扩散系数（ADC）、扩散系数（diffusion coefficient,D）、假扩散系数（pseudo-diffusion coefficient,D*）、灌注分数 （perfusion fraction, PF）。 腹部选取兴趣区（ROI）时以病灶最大层面为中心层面，同时选取其上、下各一层面逐层勾画病灶边界并分别进行测量，避开肉眼可见的周围血管或胆管，以及坏死、囊变、出血和伪影，每个病灶均测量3 次，采用MADC 软件双指数模型中mono-expontial 拟合算法模型记录各参数， 并取其平均值用作统计分析。 所有影像及数据由2 名有10 年以上工作经验的腹部影像专家采用双盲法分析测量， 取2 名测量者的数据平均值作为最终结果。

表1 肝脏3.0 T MRI 常规序列及多b 值IVIM 成像序列参数

1.4 病理分析及分级 HCC 病理切片经HE 染色后参照Edmondson-Steiner 分级标准[5]：Ⅰ级，分化良好，核/质比接近正常，瘤细胞体积小，排列成细梁状；Ⅱ级，细胞体积和核/质比较Ⅰ级增大，核染色加深，有异型性改变，胞浆呈嗜酸性颗粒状，可有假腺样结构；Ⅲ级：分化较差，细胞体积和核/质比较Ⅱ级增大，细胞异型性明显，核染色深，核分裂多见。 采用Weidner 方法对α-SMA、CD34-MVD 进行计数，将获取的每张病理切片记录5 个高倍视野下CD34-MVD、α-SMA 染色数目， 取其平均值作为该标本的最终指标值。

1.5 统计学分析 采用SPSS19.0 统计软件对数据进行分析。 采用Shapiro-Wilk 法对计量资料做正态性检验， 符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；非正态分布的计量资料以中位数（四分位距）[M（P25，P75）]表示。 采用Pearson 相关或Spearman 相关分析双变量相关性，0.1≤|r|＜0.3 呈弱相关，0.3≤|r|＜0.5 呈中度相关，|r|≥0.5 呈强相关。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IVIM-DWI 多定量参数与HCC 病理免疫组化指标的相关性 IVIM-DWI 的平均ADC 值为（1.51±0.41）×10-3mm2/s、D 值为（1．14±0．37）×10-3mm2/s、D*值为35 （26.00，41.60）×10-3mm2/s、PF 值为1.03%（0.83%，1.46%），见图1。 病理免疫组化指标CD34-MVD 平均值为49.78±9.30、α-SMA 平均值为152.33±16.57，见图2。ADC、D 值分别与CD34-MVD（r=-0.373，P=0.042；r=-0.541，P=0.002）、α-SMA（r=-0.295，P=0.013；r=-0.565，P=0.001）呈负相关，D*、PF 值分别与CD34-MVD（rs=0.526，P=0.003；rs=0.474，P=0.008）、α-SMA（rs=0.456，P=0.011；rs=0.468，P=0.009）呈正相关。且ADC、PF 值与CD34-MVD 呈中度相关，D、D*值与CD34-MVD 呈强相关；ADC 与α-SMA 呈弱相关，D*、PF 值与α-SMA 呈中度相关，D 值与α-SMA呈强相关。

图1 HCC 病人，女，74 岁。 A-D 图为多b 值（0～1 000 s/mm2）IVIM-DWI 后处理图像，白箭和红箭分别为病灶和正常肝脏背景ROI。 病灶和背景对应的ADC、D、D*、PF 值分别为1.72×10-3 mm2/s、0.895×10-3 mm2/s、18.5×10-3 mm2/s、36.3%和1.08×10-3 mm2/s、0.673×10-3 mm2/s、20.3×10-3 mm2/s、29.7%。

2.2 HCC 病理分级与IVIM-DWI 定量参数、免疫组化指标的相关性 ADC、D 值与HCC 病理分级呈中度负相关（分别为r=-0.482，P=0.007；r=-0.463，P=0.010），D*、PF 值与HCC 病理分级呈中度正相关（分别为r=0.447，P=0.013；r=0.462，P=0.010）。 CD34-MVD、α-SMA 与HCC 病理分级呈强正相关（分别为r=0.927，P＜0.001；r=0.840，P＜0.001）。

2.3 不同病理分级HCC 的IVIM-DWI 定量参数及免疫组化指标比较 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级HCC 比较，ADC、D及PF 值差异均有统计学意义（均P<0.05），随着病理级别的增高，ADC、D 值逐渐减小，PF 值逐渐增大；各分级间D*值差异无统计学意义（P>0.05）。 不同病理分级间CD34-MVD、α-SMA 差异均有统计学意义（均P<0.05）， 随着病理级别的增高，CD34-MVD、α-SMA 值逐渐增大（表2）。

3 讨论

血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的关键，肿瘤的发生、发展不仅由癌细胞本身决定，肿瘤微循环状态（又称为肿瘤血管生成）对癌细胞的生长、浸润和转移同样具有重要作用[6-7]。 因此，了解调节HCC 发生、发展的分子和细胞机制，综合评价肿瘤微血管生成以及肿瘤和周围组织蛋白的表达调控对于制定治疗策略及预测预后至关重要。评估HCC 血管生成的相关病理免疫组化指标包括CD34-MVD、α-SMA等， 但是相关免疫组化因子只能用于切除的肝脏组织，无法反复、动态进行观察。 影像检查及病理分析在HCC 中相辅相成，MRI 的主要功能在于定位HCC 及评估其侵犯程度，金标准还是病理结果。有研究[8]发现，α-SMA、CD34-MVD 在HCC 进展过程中的表达显著增加， 提示2 项指标与病理分化程度有明显的相关性。因此，寻找术前可以反映α-SMA、CD34-MVD 的影像参数，对于提示预后和改进治疗方案具有重要意义。

图2 A-C 图分别为CD34-MVDⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级，镜下所示HCC 组织中CD34-MVD 数量较多；D-F 图分别为α-SMAⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级，镜下所示α-SMA 在HCC 组织中呈阳性表达（HE，×40）。

表2 不同病理分级HCC 的IVIM-DWI 定量参数与免疫组化指标比较

本研究中IVIM-DWI 多定量参数ADC、D 值与CD34-MVD、α-SMA 表 达 呈 负 相 关，D*、PF 值 与CD34-MVD、α-SMA 表达呈正相关， 表明肿瘤内CD34-MVD 表达越高，微血管数量越多，肿瘤内部微血管密度越高，微循环灌注越多，同时肿瘤内α-SMA 表达越高， 肿瘤周围间质内成纤维细胞越多，水分子受限程度越大，扩散受限。

HCC 的病理分级与其预后密切相关，是根治性切除术后复发和长期生存的独立预测因素之一[9-10]，准确区分HCC 不同病理分级对制定治疗方案和评估预后具有重要作用。 本研究结果显示，ADC、D 及PF 值与病理分级呈中度相关，并在不同病理分级之间差异有统计学意义，且随着病理级别的增加，ADC、D 值逐渐降低，PF 值逐渐增高，可能是由于随着HCC病理分级升高，肿瘤细胞密度、核质比和内部架构增加[11]，从而导致细胞内水分子扩散受限，组织内微血管再生增多。 Granata 等[12]研究显示HCC 高一级别的ADC 和D 值较低一级别的要低，即ADCⅢ级/DⅢ级＜ADCⅡ级/DⅡ级＜ADCⅠ级/DⅠ级， 本研究结果与Granata 等[12]结果相符。 以往对身体其他部位肿瘤的研究[13-14]也得出相似的结果。 而Ding 等[11]和Zhu 等[13]研究表明，PF 值与HCC 病理分级之间无相关性，并且不同病理分级间PF 值差异无统计学意义， 本研究结果与其不一致， 可能是由于PF 值容易受到其他流体现象的影响，如腺体分泌，很难区别是灌注效应或血流模式，而这些血流模式并不特定于灌注，从而导致其参数值的不稳定性。 同时，本研究中D*值在区分HCC 病理分级中差异无统计学意义。 根据IVIMDWI 理论，D* 值指IVIM-DWI 灌注参数中的假扩散系数， 可以反映组织内血管的平均血流速度和平均毛细血管段长度[15]，因此D*的结果可能与病变和供血动脉的位置有关， 在扫描过程中随着呼吸运动内在波动性较大。此外，D*值具有内在的不稳定性、较差的重复性以及较低的诊断效能[16]，故不能准确评估肿瘤分化等级。 因此，IVIM-DWI 灌注参数与HCC 病理分级之间的关系仍存在争议。

本研究还发现，α-SMA、CD34-MVD 与病理组织学分级具有很高的相关性， 并随着病理级别的增高，CD34-MVD、α-SMA 值逐渐增大， 表明高级别HCC 较低级别HCC 的α-SMA、CD34-MVD 的表达增加， 这可能是由于作为反应性基质的主要细胞成分α-SMA 的高表达使更多活化的成纤维细胞通过释放生长因子、 细胞外基质蛋白和血管生成因子而促进肿瘤进展[17]，同时增加了CD34-MVD 高表达的多发新生不成熟的血管生成和高度血管化的肿瘤区域[18]，这与Hectors 等[19]研究结果一致。

本研究尚存在一定局限性：①样本量较少，病例选择中可能存在潜在的偏倚； ②b 值的选择尚无统一标准，IVIM-DWI 参数选择对b 值的范围、大小均有要求， 同时参数测量的可重复性及稳定性较大程度取决于影像质量（包括信噪比及位置匹配）等，设定不同b 值范围及大小对IVIM-DWI 所得定量参数是否具有可比性， 设定不同b 值时测量的参数是否具有一致性尚待进一步探讨；③D* 值和PF 值不稳定导致结果存在可能的误差。

综上所述，IVIM-DWI 的多定量参数ADC、D 及PF 值可反映HCC 的病理组织学信息及微循环功能状态。 IVIM-MRI 作为一种无创、高重复性的MR 成像技术，可为临床术前评估HCC 的病理分级和预测病人预后提供帮助，也为评估HCC 的诊断与治疗提供活体检测指标。