红藻提取物对体外瘤胃发酵特性、产甲烷和微生物生长的影响

郭善军

（达州职业技术学院，四川达州 635000）

在过去10年里，人为温室气体排放量迅速上升，值得注意的是，甲烷气体的全球变暖潜力是二氧化碳的25倍，但自19世纪初以来，其浓度增加了两倍。农业生产是甲烷排放的主要来源，特别是反刍动物养殖，其甲烷排放量占全球总量的25%（周艳等，2018）。因此，在不影响瘤胃功能的前提下，动物营养学家对减少甲烷排放非常感兴趣。部分饲料添加剂在减少动物温室气体排放方面具有很大潜力，同时也可以改善饲料利用率，提高动物生产性能（Grainger和Beauchemin，2011）。潜在的饲料添加剂包括卤化类似物、单宁素和一系列植物化合物，如精油、皂苷和各种次生代谢产物。藻类是一种很具前景的饲料添加剂，有各种各样的形式，根据大小可分为微藻类与大藻类，根据主要色素可分为绿色、红色或棕色，其中大藻类是代谢必需化合物的丰富来源，包括各种矿物质、维生素、蛋白质、脂类和多糖，因此，大藻类添加剂可以提高反刍动物饲料质量、生长速度、饲料转化效率，降低反刍动物肠道甲烷排放（Bozic等，2009）。但很少有研究确定藻类饲料添加剂如何影响反刍动物瘤胃发酵特性和甲烷减排。因此，本研究旨在探讨红藻提取物对体外瘤胃发酵参数和甲烷排放的影响。

1 材料与方法

1.1 瘤胃体外发酵设计 选择一只体重为（450±30）kg带有瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体，试验动物可以自由舔饲矿物质维生素盐块和饮水。每天在早上9点和下午5点用苜蓿草和浓缩料搭配（60∶40）的全混合日粮饲喂1次，饲喂量为奶牛体重的2%。早上饲喂前收集瘤胃液，四层纱布过滤后用人工唾液稀释，保存在39℃。将15 mL的混合物厌氧分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和红藻提取物。用铝盖丁基橡胶塞在纯氮气中厌氧密封，置于摇瓶箱中，体外发酵试验采用完全随机区组设计，一式三份，使用126个血清瓶（6次处理×7次孵育×3次重复）。

1.2 瘤胃发酵特征和微生物生长速度 使用可拆卸压力传感器和数字可读电压表，用气相色谱法测定样品中的总气体产量，使用羧酸-1006 Plot毛细管柱TCD检测器测量甲烷和二氧化碳含量。然后取无盖血清瓶对培养基进行采样，进行pH、氨氮和挥发性脂肪酸分析。用紫外/可见分光光度计在630 nm处测定。参考Denis等（2010）研究方法分析干物质体外瘤胃发酵降解率。发酵周期结束时以3000×rpm离心样品3 min，去除饲料颗粒。上清以14000×rpm再次离心3 min，得到蛋白和葡萄糖分析的最终上清样品。部分上清液采用考马斯亮蓝 G-250染色，在595 nm处分光光度法测定OD蛋白含量。测量取200 μ L上层清液加入600 μ L DNS、沸水孵育5 min，葡萄糖浓度为595 nm处的OD值。用磷酸钠缓冲液（pH 6.5）将离心得到的颗粒再洗涤4次，然后在550 nm处进行OD测量，以评估微生物的生长速度。

1.3 统计分析 所有数据均采用SAS一般线性模型程序进行分析，各处理间均值差异采用Duncan's进行多重比较，数据以“平均值±标准误差”表示，显著性为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 瘤胃体外发酵特征 由表1可知，与对照组相比，红藻提取物组提高了发酵6、9、12和72 h的pH（P＜0.05），处理1组显著提高了6和12 h的pH（P＜0.05）。处理组较对照组显著降低了瘤胃体外发酵3和6 h气体产量（P＜0.05），但处理2组显著提高了24和72 h的气体产量（P＜0.05）。除了处理4组在72 h显著降低了干物质损失率外（P＜0.05），对照组与其他处理组对干物质损失率无显著影响（P＞0.05）。

由表2可知，红藻提取物组较对照组显著降低了瘤胃体外发酵12和24 h甲烷排放量（P＜0.05），但处理3组较对照组显著提高了9 h二氧化碳排放量（P＜0.05）。红藻提取物组较对照组显著提高了9 h氨氮排放量（P＜0.05）。

表1 不同红藻提取物对瘤胃微生物体外发酵的影响

表2 不同红藻提取物对瘤胃发酵甲烷、二氧化碳和氮排放的影响

由表3可知，红藻提取物组改善了12和24 h瘤胃发酵乙酸产量（P＜0.05）。瘤胃体外发酵12 h 后红藻提取物组较对照组显著提高了丙酸产量（P＜0.05），同时也显著降低了乙酸和丙酸比值（P ＜ 0.05）。

表3 不同红藻提取物对瘤胃乙酸和丙酸含量的影响

2.2 瘤胃微生物生长速度、蛋白质和葡萄糖浓度 由表4可知，与对照组相比，红藻提取物组显著降低了6 h瘤胃微生物的生长速度（P＜0.05），但处理1组显著提高了24 h瘤胃微生物生长速度（P＜0.05）。此外，除了处理2和3组外，其他处理组较对照组均显著提高了瘤胃发酵9 h的蛋白质浓度（P＜0.05）。处理3组在瘤胃发酵3 h时降低了葡萄糖浓度（P＜0.05），但处理1和2组在24 h、处理3组在48 h均显著提高了葡萄糖浓度（P＜ 0.05）。

表4 不同红藻提取物对瘤胃微生物生长速度、蛋白质和葡萄糖浓度的影响

3 讨论

总的来说，在红藻提取物处理组中，pH始终保持在6.12～7.47之间。有趣的是，对照组发酵后pH最低，这表明添加红藻提取物在微生物发酵过程中创造更碱性的环境。由于瘤胃微生物活性的理想pH在5.0～7.8之间，所以海藻提取物可能有负面影响（Ha等，2005）。红藻提取物增加了总气体产量，而干物质降解率没有任何差异。此外，所有红藻提取物处理组的总产气量仅在24和72 h孵育时显著高于对照组，这暗示了一种提高饲料效率的策略。虽然利用陆生植物来调控肠道甲烷排放已被广泛研究，但本研究证明了红藻提取物可以有效降低体外甲烷排放，改变瘤胃微生物多样性，这与Dubois等（2013）的研究结果一致。

红藻提取物显著降低了6 h微生物生长速率，但在24 h孵育后增加，这种模式可能是因为瘤胃微生物在第6小时适应了不断变化的环境条件，并在24 h成指数生长。48 h后养分枯竭，可能会抑制微生物生长。此外，我们还观察到，微生物生长速率越高的红藻提取物处理组总产气量越高，pH越低，这一结果与Ha等（2005）的研究一致，即瘤胃微生物生长速率与总产气量和发酵密切相关。尽管瘤胃氨浓度随饲料蛋白质比例和降解速率变化而变化，使用苜蓿草为唯一底物导致氨浓度没有显著差异（除了6 h）。维持瘤胃微生物增长的最适氨浓度为8 mg/dL，而当氨浓度≥140 mg/dL时会抑制微生物生长（Ha等，2005），同时，维持最佳氨浓度可以提高大多数瘤胃微生物的蛋白质合成，但这两个变量不相关。总的来说，观察到的氨浓度为1.90～30.80 mg/dL时是瘤胃正常发酵的一个强有力的指标，没有显示出红藻提取物具有负面影响。反刍动物瘤胃微生物发酵释放的挥发性脂肪酸是主要终产物，而不是葡萄糖。本研究发现，丙酸在12和24 h瘤胃发酵后显著增加，葡萄糖浓度在24和48 h相应增加，这一结果与丙酸是最丰富的葡萄糖生成基质（Larsen 和 Kristensen，2009）。

4 结论

红藻提取物是一种可行的饲料添加剂，可以提高反刍动物的瘤胃发酵产气量，降低乙酸和丙酸比值，减少甲烷排放。但还需进一步评估红藻提取物对反刍动物采食量、饲料利用效率和甲烷减排的影响及其机理。