PD98059联合紫杉醇对人胃印戒细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

赛福丁·柯尤木 布力布·吉力斯汉 马兰英 李娜 阿布拉江·塔依尔 刘翠云 舍玲 唐勇

摘 要 目的：探讨丝裂原激活蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）通路特异性抑制剂PD98059联合紫杉醇对人胃印戒细胞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法：以人胃印戒细胞癌KATOⅢ细胞为对象，采用CCK-8法检测紫杉醇、PD98059以及两药联合作用48 h后的细胞增殖情况，并计算增殖抑制率;采用流式细胞术、Western blotting、Transwell法分别检测紫杉醇、PD98059以及两药联合作用48 h或24 h后的细胞凋亡、凋亡相关蛋白[分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）]表达和细胞迁移情況。结果：经紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（5、20、40 μmol/L）以及两药（1 μg/mL+5、20、40 μmol/L）联合作用后，各给药组细胞的增殖抑制率均显著升高，且联用组显著高于紫杉醇、PD98059同剂量单用组（P<0.05）。经紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（40 μmol/L）以及两药（1 μg/mL+40 μmol/L）联合作用后，紫杉醇组和两药联用组细胞的早期、晚期凋亡率以及Cleave-caspased-3蛋白的表达量均显著升高，且联用组显著高于紫杉醇、PD98059单用组（P<0.05）;各给药组的细胞迁移数均显著减少，且联用组显著少于紫杉醇、PD98059单用组（P<0.05）。结论：紫杉醇、PD98059均可抑制人胃印戒细胞癌KATO Ⅲ细胞的增殖和迁移，且紫杉醇还可促进该细胞的凋亡及凋亡相关蛋白的表达，上述作用可能与抑制MEK/ERK通路有关。两药联用的效果优于紫杉醇或PD98059单用。

关键词 人胃印戒细胞癌;紫杉醇;PD98059;增殖;凋亡;凋亡相关蛋白;迁移;丝裂原激活蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶通路;KATO Ⅲ细胞

ABSTRACT   OBJECTIVE： To investigate the effects of MEK/ERK pathway specific inhibitor PD98059 combined with paclitaxel on the proliferation and apoptosis of human gastric signet ring cell carcinoma （SRCC） cells. METHODS： Using human SRCC KATO Ⅲ cells as object， CCK-8 assay was used to detect cell proliferation after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 h， and the proliferation rate was calculated. Flow cytometry， Western blotting and Transwell assay were used to detect the cell proliferation， the expression of apoptosis related protein （Cleaved-caspase-3） and cell migration after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 or 24 h. RESULTS： After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+5， 20， 40 μmol/L）， the proliferation rate of cells was increased significantly in administration groups， and the combination groups were significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone groups （P<0.05）. After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+40 μmol/L）， early and late apoptosis rate， the protein expression of Cleaved-caspase-3 were significantly increased in paclitaxel group and combination group; combination group was significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. The number of migrated cells in administration groups were reduced significantly， and the combination group was significantly lower than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Paclitaxel and PD98059 can inhibit the proliferation and migration of human SRCC KATO Ⅲ cells， paclitaxel can also promote the apoptosis and the expression of apoptosis related protein， which may be related to the inhibition of MEK/ERK pathway. The effect of the combination of the two drugs is better than paclitaxel or PD98059 alone.

KEYWORDS   Human grastric signet ring cell carcinoma; Paclitaxel; PD98059; Proliferation; Apoptosis; Apoptosis related protein; Migration;MEK/ERK pathway; KATO Ⅲ cells

胃印戒细胞癌是基于微观组织形态学分型的一种特殊病理类型的胃癌，其镜检可见肿瘤细胞胞质丰富、充满黏液，细胞核被挤压于胞质一侧呈“印戒”样[1-2]。近年来，随着幽门螺旋杆菌根治术的应用，胃癌的发病率虽有所下降，但胃印戒细胞癌的发病率却有所上升，占胃癌总发病率的8%～30%[1-3];同时有报道指出，与非印戒细胞癌相比，胃印戒细胞癌多发于年轻女性[4]。目前，胃印戒细胞癌的临床治疗主要以手术及化疗为主，但胃印戒细胞癌患者对化疗药物不敏感，且肿瘤细胞一旦突破黏膜下层，则极易发生转移，导致患者预后不佳[5]。PD98059是一种丝裂原激活蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）通路的特异性抑制剂，能有效阻止MEK对ERK的磷酸化，阻滞细胞内相关通路信号的转导，从而影响肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等一系列生物反应[6]。紫杉醇作为一种天然植物来源的抗癌药物，广泛应用于包括胃癌在内的多种肿瘤的临床治疗，其单药有效率达20%～40%，但随着作用时间的延长，靶癌细胞产生的分子学抵抗限制了该药抗癌作用的发挥[7-8]。有研究指出，PD98059与紫杉醇等其他抗肿瘤药物联用可增强后者的抗癌效果[9];且本课题组前期研究也有类似发现。基于此，本研究拟通过分析PD98059联合紫杉醇对人胃印戒细胞癌细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨联合用药的抗癌效果，旨在为胃印戒细胞癌的治疗提供新的靶点和思路。

1 材料

1.1 仪器

FORM 361型细胞培养箱、MK2型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）;Accuri C6型流式细胞仪（美国BD公司）;Mini-Protean型蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）;5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）;Ti-E型显微镜（日本Nikon公司）;5702型常温离心机（德国Eppendrof公司）。

1.2 药品与试剂

紫杉醇对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号：IP0020，纯度：>98%）;PD98059对照品（美国MCE公司，批号：12764，纯度：99.33%）;IMDM培养基、胎牛血清、胰酶（美国Gibco公司，批号分别为8228124、41G3332K、1730153）;Transwell测试盒（美国Corning公司，批号：27113030）;CCK-8试剂盒、含磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶配胶试剂盒、结晶紫染色试剂（上海碧云天生物科技有限公司，批号分别为C0038、P0013B、P0010、P0015L、P0012AC、C0121）;膜联蛋白Ⅴ-硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡检测试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：1753025）;山羊抗兔分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗体、山羊抗兔甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗（美国CST公司，批号分别为12/2017、10/2017、06/2017）;ECL发光试剂盒（美国Millipore公司，批号：1722003）;其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞

人胃印戒细胞癌细胞株KATO Ⅲ由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

2 方法

2.1 细胞培养

将胃印戒细胞癌KATO Ⅲ细胞解冻、复苏并接种至含有10%胎牛血清的IMDM培养基（以下简称“完全培养基”）中，于5%CO2、37 ℃条件（下同）下培养，约3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行后续试验。

2.2 细胞增殖情况

采用CCK-8法检测。取对数生长期的KATO Ⅲ细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至5×104个/mL，按100 μL/孔接种至96孔板中，培养24 h，将细胞随机分为对照组，紫杉醇组（1 μg/mL），PD98059低、中、高剂量组（5、20、40 μmol/L）以及紫杉醇+PD98059联用组（1 μg/mL紫杉醇分别与5、20、40 μmol/L PD98059联用），各给药组剂量参考本课题组前期预试验结果设置，每组设3个复孔。对照组加入完全培养基100 μL，各给药组加入含相应药物的完全培养基100 μL，继续培养48 h。弃去培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养1 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔光密度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率=[（对照组细胞平均OD值-试验组细胞平均OD值）/对照组细胞平均OD值]×100%。上述试验重复3次（下同）。

2.3 细胞凋亡情况

采用流式细胞术检测。取对数生长期的KATO Ⅲ细胞，经胰酶消化后，将其用完全培养基调整至5×106个/mL，按100 μL/孔接种至6孔板中，培养24 h，将细胞随机分为对照组、紫杉醇组（1 μg/mL）、PD98059组（40 μmol/L）和紫杉醇+PD98059联用组（1 μg/mL+40     μmol/L），各给药组剂量参考“2.2”项下结果设置，每组设3个复孔。对照组加入完全培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基2 mL，继续培养48 h。收集细胞，以800 r/min离心5 min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗3次。随后用PBS调整细胞密度至1×106个/mL，取上述细胞悬液1 L，以800 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入Annexin Ⅴ-FITC结合液195 μL，轻轻重悬，然后依次加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL和PI染色液10 μL，轻轻混匀，于冰浴中染色20 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并使用Excel 2007软件计算各組细胞的早期、晚期凋亡率。

CCK-8试验结果显示，各给药组细胞的增殖抑制率均较对照组显著升高，且两药联用组的抑制率显著高于紫杉醇、PD98059同剂量单用组;同时，20 μmol/L PD98059的抑制作用与1 μg/mL紫杉醇相当，且抑制率有随PD98059剂量增加而升高的趋势。由此可见，两药联用对细胞增殖的抑制作用明显优于紫杉醇、PD98059单独使用，这可能与PD98059对细胞增殖的抑制主要是作用于G1期，将细胞周期阻滞在G0/G1期[17]，而紫杉醇则主要是将细胞周期阻滞在G2/M期[10-11]有关。

有研究指出，减少细胞凋亡信号通路中ERK的磷酸化能有效抑制胱天蛋白酶9（Caspase-9）的表达，从而发挥减少细胞凋亡的作用，因此抑制MEK/ERK通路常作为诱导肿瘤凋亡的靶点[18]。Caspase-9作为凋亡通路的启动者，在收到上游信号后，可通过自剪接而激活，随后引发Caspase的级联反应。Caspase-3作为Caspase-9的响应分子之一，在被Caspase-9激活后，其可通过剪切产生活性Cleaved-caspase-3，后者可直接降解细胞内的结构蛋白和功能蛋白，从而诱导细胞凋亡[18-19]。本研究通过流式细胞术和Western blotting法分别检测了KATO Ⅲ细胞的凋亡情况和凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表达水平。结果显示，与对照组比较，紫杉醇组和紫杉醇+PD98059联用组细胞的早期、晚期凋亡率和Cleaved-caspase-3的相对表达量均显著升高，且联用组显著高于紫杉醇、PD98059单用组;而虽PD98059有增加细胞凋亡和凋亡蛋白表达的趋势，但组间比较差异均无统计学意义。这提示PD98059单独使用时，对胃印戒细胞癌细胞的促凋亡作用并不明显;而当该药与紫杉醇联用时，则可明显促进细胞的凋亡，提高相关凋亡蛋白的表达水平，并可同时增强紫杉醇对KATO Ⅲ细胞的促凋亡作用，其机制可能与PD98059通过抑制MEK/ERK通路从而增强细胞对紫杉醇的敏感性有关[20]。

本研究进一步通过Transwell法检测了PD98059联合紫杉醇对KATO Ⅲ细胞迁移能力的影响。结果显示，各给药组的迁移细胞数均较对照组显著减少，且联用组显著少于紫杉醇、PD98059单用组。这提示两种药物均可抑制KATOⅢ细胞的迁移，其中紫杉醇可通过降低相关细胞机能、PD98059可通过抑制ERK磷酸化来减少基质金属蛋白酶2等的表达，从而发挥迁移抑制作用[21]。与此同时，两药联用的抑制作用强于任一药物单用，笔者推测这可能与两药效果叠加有关。

综上所述，紫杉醇和PD98059均可抑制人胃印戒细胞癌KATO Ⅲ细胞的增殖和迁移，且紫杉醇还可促进该细胞的凋亡及凋亡相关蛋白的表达，上述作用可能与抑制MEK/ERK通路有关;两药联用的效果明显优于紫杉醇或PD98059单用。本研究可为胃印戒细胞癌的临床治疗提供新策略，但PD98059协同紫杉醇对人胃印戒细胞癌细胞发挥抑制作用的分子机制仍未明确，且相关研究结论并未通过体内研究予以证实，故有待进一步探索。

参考文献

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