外源脯氨酸对番茄体内残留百菌清降解的调控作用

刘新宇，陈 鹏，张光辉，赵俊杰，李博浩，张 南，孙韦珂，许娟娟，叶行涛，魏金鹏，于高波，*

(1.黑龙江八一农垦大学 园艺园林学院，黑龙江 大庆 163319； 2.广西大学 农学院，广西 南宁530001)

番茄(LycopersiconesculentumMiller)，茄科番茄属，果实营养价值丰富，是一种世界性的蔬菜作物，也是国民非常喜爱的蔬菜之一[1]。在番茄生产中，灰霉病、早疫病、晚疫病和炭疽病等病害经常大面积发生。为了有效地控制番茄等蔬菜种植中病害的发生，生产中常采用各种杀菌剂进行病害防治。其中，百菌清(chlorothalonil，CHT)作为一种常用的杀菌剂，因具有较强的黏着性和广泛的实用性，常被应用于蔬菜病害的防控。其用药安全期多为25 d[2]，但已有研究表明，其对鱼类和两栖类动物等均存在着较高的风险[3]。对于植物而言，农药是一种异源有毒物质，施用过多会对植物产生药害，引起细胞膜透性增加等生理生化指标变化，以及代谢异常、植株品质、抗性及产量下降等[4]。生产中经常存在用药过量等不合理用药现象，导致番茄农残超标，影响产品的品质和人们的身体健康。因此，关于番茄体内残留农药降解代谢的研究对于促进番茄安全生产来说具有重要的现实意义，如何降低番茄上的农药残留量成为亟待解决的问题[5]。已有研究表明，通过洗涤、浸泡、去皮等方式可不同程度地去除残留于果蔬表面的一部分农药，但另一部分会被蔬菜作物通过叶片、根系直接或间接吸收，进入到组织内部，最后残留于蔬菜体内[6]。植物在长期进化的过程中已经形成了一套解毒机制，作物对除草剂等农药的解毒过程可分为4个阶段，包括：(1)细胞色素P450和过氧化物酶等的氧化水解作用；(2)通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)或糖基转移酶等催化的生化反应；(3)特定的膜相关转运体(ABC转运蛋白等)介导的有毒物质区域隔离；(4)水解酶参与的降解反应[7]。前两项代谢可将有毒的大分子基团破坏，形成毒性低、移动性差的代谢产物；后两项负责低毒性小分子物质的进一步水解与转运[8]。

1 材料与方法

1.1 材料培养与试验设计

试验在黑龙江八一农垦大学园艺实验实习基地内进行。以番茄品种浙杂205为供试材料，由浙江省农业科学院提供；以脯氨酸为预处理试剂，购于Sigma公司；以百菌清75%可湿性粉剂为供试试剂，深圳诺普信农化股份有限公司生产。采用穴盘播种育苗，待2片真叶时定植于大棚内，田间试验常规管理。当植株长至6片真叶时，进行试验处理与取样。

试验处理：以蒸馏水预处理为对照CK，以3 mmol·L-1脯氨酸(Pro)预处理为处理，预处理24 h后，叶面喷施11.2 mmol·L-1百菌清(CHT)。在CHT处理后的0、3、6、12、24、36、48、96、168 h时间点取样，重复3次，-20 ℃保存，用于生理生化指标的测定。在农药处理后168 h取样，-20 ℃保存，用于百菌清残留量测定分析。以未作任何处理的为空白对照。

1.2 百菌清残留量测定

番茄体内样品残留的百菌清，利用60～90 ℃石油醚与40 g无水硫酸钠浸提，滤液经真空抽离后，采用旋转蒸发仪蒸发，提取液经弗罗里硅土固相萃取柱(SPE)净化吸附，采用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)进行残留量的测定分析[14]。

气相色谱检测条件为：GC-ECD(Agilent Santa Clara，CA，USA)；色谱柱：30 m×0.32 mm，0.25 μm；载气：氮气；流速：3.3 mL·min-1；进样口温度：250 ℃；检测器温度：300 ℃；柱温：以25 ℃·min-1的速度由80 ℃升至260 ℃，最终保持3.8 min[15]。

1.3 抗氧化系统和解毒酶活性测定

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 21.0对所得数据进行处理和统计分析，用Origin 2016软件绘图。

2 结果与分析

2.1 外源脯氨酸预处理对番茄体内百菌清残留量的影响

通过农药百菌清处理168 h的番茄体内的百菌清残留量检测可知(图1)，外源Pro预处理的番茄叶片中的农药百菌清的残留量显著(P<0.05)低于对照。与对照相比，Pro预处理的番茄叶片百菌清残留量下降了42.46%。因此，外源脯氨酸能够有效地促进番茄体内百菌清的降解代谢，降低番茄体内百菌清残留量。

2.2 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内产生速率和H2O2含量的影响

不同字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)。Different letters indicated significant difference at 0.05 levels.

产生速率和H2O2含量均以鲜质量计。*表示与空白处理相比差异显著(P<0.05)。 production rate and H2O2 contentwas measured by fresh weight. * represented significant(P<0.05)difference compared with the blank treatment.

2.3 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内GSH/GSSG比值的影响

由图3可知，外源Pro预处理后处理百菌清，其GSH/GSSG从整体上高于CK对照，并且在农药处理3～6 h和36～168 h均显著(P<0.05)高于CK。随百菌清处理时间的延长，外源Pro预处理和蒸馏水CK预处理后处理百菌清的番茄体内GSH/GSSG的变化整体呈现先上升后下降、最后趋于稳定的趋势。

*表示与CK相比差异显著(P<0.05)。下同。* represented the significant difference compared with CK (P<0.05). The same as below.

由图4可知，外源Pro预处理和蒸馏水预处理后处理百菌清的番茄体内GSH含量变化整体上呈现逐渐上升的趋势，其中外源Pro预处理在农药处理3～24 h均显著(P<0.05)高于CK。说明外源Pro可以促进GSH的合成，进一步促进解毒酶活性的提高，加速百菌清的降解。

2.4 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内抗氧化酶活性的影响

GSH含量以鲜质量计。GSH content was measured by fresh weight.

由图5-A可知，与CK相比，外源Pro预处理在一定程度上提高了农药处理的番茄MDAR活性，在0～3 h和36～48 h，外源Pro预处理的番茄MDAR活性显著(P<0.05)高于CK，其他时期与CK无显著性差异，其活性随着农药处理后时间的延长不断下降，在农药处理96 h后，恢复至对照水平。外源Pro预处理可促进MDAR活性的提高，利于植物体内抗坏血酸的合成，从而增强番茄的抗氧化性。由图5-B可知，与CK对照相比，外源Pro预处理后农药处理的番茄SOD活性均高于CK，在农药处理168 h之前，差异均达到显著性水平(P<0.05)。其中，外源Pro预处理在农药处理24 h处SOD活性达到最高值。由图5-C可知，在农药处理12 h之前，外源Pro预处理与CK的番茄CAT活性，二者之间无显著差异，而农药处理24 h时，外源Pro预处理的番茄CAT活性显著(P<0.05)低于CK，而农药处理36 h后，番茄CAT活性显著(P<0.05)升高，说明外源Pro预处理可提高农药处理36 h后番茄的CAT活性。由图5-D可知，在农药处理6 h之后，外源Pro预处理能显著(P<0.05)提高番茄的POD活性，其中，农药处理6 h处外源Pro预处理的番茄体内POD活性达到最大值，较CK提高了23.02%。由图4-E可知，除了农药处理3 h外，外源Pro预处理不同限度地提高了番茄APX活性，并且在农药处理0、6～36、96 h时间点时差异达显著水平(P<0.05)。这说明外源Pro预处理可直接或间接促进抗氧化酶活性的提高，从而提高番茄植株的抗氧化能力。

酶活性均以鲜质量计。下同。Enzyme activity was measured by fresh weight. The same as below.

2.5 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内解毒酶活性的影响

由图6-A可知，外源Pro预处理提高了番茄解毒酶谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的活性，除了农药处理24 h和96 h外，其他时期外源Pro预处理和CK间差异均达显著性水平(P<0.05)。这说明外源Pro预处理可通过诱导解毒酶GST活性的提高，从而有效地促进番茄体内残留农药百菌清的降解代谢。由图6-B可知，在农药处理0～3 h，外源Pro预处理的番茄GR活性显著(P<0.05)低于CK，而在农药处理6 h以后，外源Pro预处理的番茄GR活性显著(P<0.05)高于CK。因此，外源Pro预处理能够促进GR活性的提高，从而提高番茄植株的抗氧化能力和解毒能力。

2.6 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内NPT含量的影响

由图7可知，随着百菌清处理时间的延长，外源Pro预处理与CK对照的农药处理后番茄体内非蛋白巯基化合物(NPT)含量的变化整体呈上升趋势。在农药处理6～24 h时，外源Pro预处理的番茄体内NPT含量显著(P<0.05)高于CK。这说明外源Pro预处理可以加速百菌清的降解代谢，促进番茄体内非蛋白巯基化合物NPT的形成。

3 讨论与结论

图6 外源脯氨酸预处理对农药迫下番茄体内解毒酶活性的影响Fig.6 Effects of exogenous proline pretreatment on detoxification enzyme activities of tomato under pesticide stress

NPT含量以鲜质量计。NPT content was measured by fresh weight.图7 外源脯氨酸预处理对农药胁迫下番茄体内NPT含量的影响Fig.7 Effects of exogenous proline pretreatment on NPT content in tomato under pesticide stress

另外，谷胱甘肽还原酶GR及谷胱甘肽也参与了植物细胞中抗氧化过程。已有研究证明，GR可催化氧化态谷胱甘肽GSSG还原为还原态的GSH，从而促进GSH的再生，提高GSH/GSSG比例，利于活性氧的清除[31-32]。GR不仅是植物细胞内部H2O2清除酶系统的重要组成部分[33]，而且是植物谷胱甘肽解毒系统的主要成员，与解毒酶GST在植物体内残留农药的降解过程中发挥着重要的解毒作用[1，6]。本试验结果表明，外源Pro预处理能显著提高农药胁迫下番茄的GR活性，促进GSH的再生，提高GSH/GSSG和GST酶活性，从而提高植株的抗氧化能力与解毒能力，促进番茄体内百菌清的降解。许馨露等[34]研究发现，干旱、高温，及其协同胁迫可以提高GSH/GSSG；颜志明等[33]研究发现，外源Pro预处理可以显著提高盐胁迫下甜瓜的GSH/GSSG，这与本试验结果一致。本研究发现，外源Pro预处理可提高GSH/GSSG，加速氧化型谷胱甘肽(GSSG)向还原型谷胱甘肽(GSH)的转化，从而激活体内抗氧化酶活性，提高番茄的抗氧化能力。还原型谷胱甘肽GSH作为植物体内抗氧化还原非酶系统中的主要成员，既可通过酶促或非酶促反应清除活性氧，也可通过谷胱甘肽-抗坏血酸循环途径调控GSH/GSSH等氧化还原状态，清除活性氧[35-36]。在植物体通过GSH清除活性氧的同时，GSH自身被氧化成GSSG，GSSG在GR的催化作用还原为GSH，保证植物体所需要的GSH含量，维持机体相对稳定的GSH/GSSG氧化还原平衡，保持植物体清除ROS的能力，并且GSH/GSSG也反映着植物的氧化还原状态，可诱导植物的抗氧化酶等参与生理生化反应的调控。在植物中，谷胱甘肽一方面能够减少由于外源胁迫而产生的ROS积累，缓解其对植物机体的伤害作用[37]；另一方面，谷胱甘肽又能够在谷胱甘肽转移酶(GST)的催化作用下与异源有毒物质结合，促进有害物质的区域化降解[38]。本研究中外源Pro预处理显著提高了番茄植株抗氧化能力，激活了GSH的再生，增加了GSH/GSSG，提高了GST活性，增强了植物的解毒能力，加速了番茄体内百菌清的降解。

本试验表明，外源喷施3 mmol·L-1Pro预处理可显著激活番茄的谷胱甘肽解毒系统，促进百菌清降解代谢，促进非蛋白巯基化合物(NPT)的形成，降低番茄体内残留的百菌清含量。其中，NPT主要包括谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PC)和半胱氨酸(Cys)等，其在农药化学物质的解毒、农药化学物质引起的氧化胁迫防御和农药化学物质降解代谢方面具有重要作用[16]。本研究发现，外源Pro预处理可以显著提高农药胁迫下番茄体内的NPT含量和GSH/GSSG，说明NPT参与了番茄体内谷胱甘肽的代谢。基于ROS和谷胱甘肽在植物解毒途径中功能的保守性，脯氨酸也可应用于其他蔬菜残留农药降解代谢的调控，但具体调控效果尚有待于进一步研究。