甘薯新品种茎尖培养及病毒检测技术

许泳清 李华伟 邱永祥 林赵淼 张鸿 李国良 邱思鑫

摘 要：為了优化甘薯茎尖培养方法，获得甘薯新品种脱毒试管苗。采用正交试验法，研究NAA、GA3和6BA三种因素对甘薯茎尖分化和植株再生的影响，筛选培养基最佳配方;在正交试验基础上，进一步考察不同甘薯品种在最佳培养基组合的茎尖分化和植株再生情况;并用RTPCR方法对成苗的甘薯品种再生株系进行病毒病（SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV）检测。结果表明：各试验因素对福薯604茎尖分化成苗影响的主次关系为6BA>NAA>GA3，福薯604茎尖组培成苗的最佳组合为MS培养基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+

GA3 0.1 mg·L-1，其茎尖组培苗萌芽率为93.3%、成苗率达50.0%。不同甘薯品种在最佳培养基组合条件下的茎尖分化情况表现不同，其中，福菜薯23和福薯116甘薯品种的茎尖分化和植株再生情况最好。不同甘薯品种试管苗经RTPCR检测，最终获得福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯16号、福薯33和福薯113等12份甘薯脱毒试管苗，可应用于实际生产。

关键词：甘薯;茎尖脱毒;RTPCR;病毒检测

中图分类号：S531 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）12-0052-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.010

Techniques of Stem Tip Culture and Virus Detection of New Sweet Potato Varieties

XU Yongqing， LI Huawei， QIU Yongxiang， LIN Zhaomiao， ZHANG Hong， LI Guoliang， QIU Sixin

（Institute of Crop Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experiment

Station of Tubers in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Fujian Engineering Research Center

for Characteristic Dry Crop Variety Breeding， Fuzhou， Fujian 350013， China）

Abstract： In order to optimize the culture method of the stem tips of sweet potato， and obtain the virusfree testtube plantlet of the new sweet potato variety， the effects of NAA， GA3 and

6BA on the differentiation of stem tips and plant regeneration of sweet potato were studied by orthogonal experiment， and then the best formula of the medium was selected. Based on the orthogonal experiment， the differentiation of stem tips and plant regeneration of different sweet potato varieties in the optimal combination of medium were further investigated， and the method of RTPCR was used to detect the virus diseases （SPFMV， SPCSV， SPVG， SPVC and SPLV） in the regenerated lines of sweet potato varieties after they became seedling. The results showed that the effects of various experimental factors on the differentiation of stem tips and plant regeneration of Fushu 604 were ordered as follows： 6BA， NAA and GA3. The optimal medium combination for the stemtip tissue culture seedling of Fushu 604 was MS medium +6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1. The germination rate and seedling rate of the stemtip tissue culture seedling were 93.3% and 50.0%， respectively. Different varieties of sweet potato showed different differentiation of stem tips under the optimal medium combination， among which the varieties of Fucaishu 23 and Fushu 116 showed the best differentiation of stem tips and plant regeneration. The testtube plantlets of different varieties of sweet potato were detected by RTPCR， and then 12 virusfree testtube plantlets of sweet potato were obtained， including Fushu No.8， Fushu 34， Fucaishu 22， Fushu 916， Fushu 90， Fucaishu 23， Fushu 116， Fushu 317， Fushu 604， Fushu No.16， Fushu 33 and Fushu 113， which could be used in the actual production.

Key words： Sweet potato; Virusfree stem tip; RTPCR; Virus detection

甘薯Ipomoea batatas L.Lam是我国第四大粮食作物，据统计2017年全国甘薯种植面积约337.3万hm2[1]。甘薯以其产量高、抗逆性强和适应性广等特点在20世纪60～70年代被广泛种植，曾作为“救命薯”救活了一代人[2]。福建省作为我国甘薯的最早引入地，种植甘薯有400多年的历史。福建省农业科学院作物研究所薯类课题组从1978年以来就开始进行甘薯育种研究工作，先后选育出了福薯87、福薯2号、福薯7-6、福菜薯18号等优良品种。近年来，由于全国各地种苗调运频繁，造成福建省甘薯病毒病愈发严重。生产上流行的甘薯病毒病种类主要有SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV等5种[3]，其中由SPCSV和SPFMV协生共侵染甘薯引起的病害为甘薯病毒病害（sweetpotato virus diseases，SPVD）[4]，SPVD是甘薯上的毁灭性病害，已成为影响甘薯的最重要病毒病之一，甘薯一旦受侵染，严重影响产量，甚至绝收。目前还没有特效药能够防治甘薯病毒病，培育抗病品种和种植健康种苗是最根本的途径，由于缺少广谱抗性的种质资源加上病毒自身的变异，给抗病品种的选育带来困难，所以培育健康种苗显得尤为重要。目前健康种苗的获得是通过茎尖脱毒培养才能获取脱毒试管苗，茎尖的成苗率和病毒检测技术越显重要。本试验通过筛选适宜的茎尖分化培养基，以提高茎尖成苗率，用RTPCR法检测试管苗，以期快速获得甘薯新品种的脱毒试管苗，为生产奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018-2019年在福建省农业科学院作物研究所埔垱实验室进行。供试甘薯品种材料为福薯604、福薯90、福薯8号、福薯317、福菜薯23号、福菜薯22号等14个甘薯新品种（表1），均是本课题组通过杂交选育出的新品种。

1.2 不同激素对诱导甘薯茎尖分化和成苗的影响

茎尖诱导培养基采用三因素四水平L16（43）正交试验设计（表2），以MS为基础培养基，NAA、6BA、GA3为试验因素，代号分别为A、B、C，各因素取4个水平，蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1，分装于21 mm×100 mm的试管中，121℃高压灭菌20 min后备用。

供试品种为福薯604。取大棚生长健壮的甘薯茎尖或薯块发芽的茎尖（约2 cm长），剪去大叶，用流水冲洗干净，置于超净工作台上进行消毒灭菌。先用75%乙醇消毒20 s，灭菌水冲洗5次，接着用0.1%升汞消毒2～3 min，灭菌水冲洗5次，放置于无菌滤纸上吸干水分，备用。在40×解剖镜下，剥去小叶片，切取带1～2个叶原基的生长点，迅速接种于配置好的试管培养基表面上，每个处理接30个茎尖，3次重复。

培养条件：在光照强度4000 lx，光照时间16 h·d-1，温度25℃的培养箱中进行培养。其间观察茎尖分化和植株再生情况，于60 d后统计成苗率（以形成2片展开叶片的植株为标准）。

1.3 不同甘薯品种茎尖分化和植株再生的形成

以MS为基础培养基，添加植物生长激素萘乙酸（NAA，0.1 mg·L-1）、6苄氨基腺嘌呤（6BA，1.2 mg·L-1）、赤霉素（GA3，0.1 mg·L-1，过滤灭菌后加入），再加入30 g·L-1蔗糖，5 g·L-1琼脂，分装于21 mm×100 mm的试管中，121℃高压灭菌20 min后备用。供试品种见表1，方法同1.2，每个品种接20个茎尖。

1.4 新成苗的甘薯試管苗主要病毒病检测

1.4.1 病毒检测引物 设计并合成了甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯退绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯病毒C（SPVC）和甘薯潜隐病毒（SPLV）特异性检测引物，引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，引物序列见表3。

1.4.2 RNA提取及cDNA合成 植物RNA及cDNA合成参照试剂盒说明进行，RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4.3 RTPCR检测和PCR产物测序 PCR反应体系25 μL：取cDNA 2 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，10 Mix μL，用ddH2O补足至总体积25 μL，混匀后离心。反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56～58℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，循环30次;最后 72℃ 延伸10 min，4℃保存。

反应结束后，取5 μL的PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压120 V，结束后将胶放置于凝胶成像仪上观察拍照。将PCR产物送至福州尚亚生物工程有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 不同激素对诱导甘薯茎尖分化和成苗的影响

福薯604在不同处理的培养基中茎尖分化情况结果列于表4。从表4可以看出，6BA是影响成苗率的主要因素（R=19.325），其次是NAA（R=17.375），影响最小的因素是GA3（R=17.250）。根据各因素在不同水平成苗率的平均值（K1、K2、K3、K4），福薯604茎尖组培的最佳配方是MS+6BA（1.2 mg·L-1）+NAA（0.10 mg·L-1）+GA3（0.10 mg·L-1），萌芽率达93.3%，成苗率达50.0%。16个处理的茎尖组织都有萌动，处理13的萌芽率最低，为76.7%，处理2、3、5、6、11的萌芽率最高，达100.0%;处理12的愈伤组织分化率最高，达77.8%，处理1、2、3、4、5、9、13的愈伤组织分化率最低，均为0。

2.2 不同甘薯品种茎尖分化和植株再生情况

从表5可以看出，不同甘薯品种在MS培养基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1培养条件下的茎尖分化情况表现不同。其中，福菜薯23、福薯116和福薯604茎尖分化最好最快，接种后3 d就可以看见生长点明显变大变绿，成苗率也高达25.6%，说明该培养基适宜以上3个甘薯品种的茎尖分化。福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90接种10 d可见茎尖分化，膨大变淡黄色，但是茎尖基部多数形成淡黄色愈伤，导致成苗速度变慢，多数茎尖成苗时间在30 d以上。福薯317、福薯16号、福薯113、福薯33等品种茎尖分化较差，接种25 d后有些生长点出现褐化。福薯203和福薯404茎尖分化情况最差，接种后生长点分化缓慢，随后变褐色干枯，未形成完整植株的茎尖，成苗率为0。

2.3 试管苗病毒检测结果

以5种病毒的RNA作模板，用筛选出的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV引物进行RTPCR扩增，得到特异性条带（图1）。利用建立的RTPCR体系对成苗的甘薯品种再生株系进行病毒检测，结果显示，其中2份样品中检测出SPFMV、SPCSV和SPVG 3种病毒，未检测出SPVC和SPLV，结果获得12份脱毒甘薯品种试管苗，分别是福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16号和福薯33。

3 结论与讨论

本试验结果表明，不同基因型甘薯品种在MS培养基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1mg·L-1培养条件下的茎尖分化和植株再生情况表现不同，福菜薯23、福薯116和福薯604茎尖分化速度很快，接种3 d后就可以看见生长点明显膨大变绿，诱导培养14 d后接分化培养基，25 d后开始成苗，成苗率可达25.6%。福薯317、福薯16号、福薯113、福薯33等品种茎尖分化较慢，接种后慢慢膨大。福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90等品种出现淡黄色愈伤，转接分化培养基后，40 d才开始部分成苗，成苗率最高仅为13.8%。福薯203和福薯404分化差，大部分茎尖出现褐化，慢慢变干枯，最后没有成苗的茎尖。这与不同品种茎尖内源激素种类和浓度有关，相关研究表明[5-9]只有通过添加外源激素，才能打破个体内源激素间的平衡，并且要有适当的浓度配比，才能使甘薯芽的分化和生长达到最佳点[10-11]。因此，针对不同基因型品种，必须筛选出适宜的激素浓度配比，才能提高成苗速度和成苗率。

培育脱毒苗是目前最为有效的防治甘薯病毒病的方法，在脱毒苗培育过程中需要对试管苗进行快速和准确的检测，因此，建立能快速、准确地检测病毒的PCR方法具有重要意义。本研究通过RTPCR检测发现，成苗的12份甘薯品种株系的病毒感染率低。其中，仅福薯604的2个再生株系检测出SPFMV、SPCSV和SPVG，其余株系均未检测出。本研究获得12份甘薯新品种的脱毒试管苗，分别为福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16号和福薯33，可进行大量扩繁应用于生产。

试验中关于影响甘薯茎尖分化诱导成苗除了本试验中考虑的因素，其他培养因素有待进一步研究探讨。本研究仅对诱导成苗的株系进行了病毒检测，未开展对携带病毒植株脱毒效果的研究。下一步将研究如何提高甘薯试管苗脱毒率和再生率。

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（责任编辑：林玲娜）