PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展

徐蕾， 肖桂清， 盛晓菁， 戚智青*， 刁勇*

1. 华侨大学生物医学学院，福建 泉州 362021；2. 福建省银丰干细胞工程有限公司，福州 350004

当前由生物类因素(细菌、寄生虫、病毒等)造成的各种人类、动植物严重流行病，例如埃博拉病毒[1]、寨卡病毒[2]、中东呼吸综合征冠状病毒[3]和新型冠状病毒[4]，已引起各国政府及媒体的普遍关注，但目前尚缺少有效的病原体疫苗及治疗措施，若不能对第一例疾病及时诊断，不仅会造成经济上的损失，更甚者直接威胁生命。对病原体的检测，传统的方法是通过体外培养病原体进行镜检，但该方法耗时长、操作繁琐、误差大,对操作人员要求也比较高,还存在一些难以培养的微生物检测困难等问题[5]。而利用免疫学方法进行的酶标法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测病原体存在“窗口期”较长易造成漏检、免疫静默感染以及人工操作误差等问题[6]，因此以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)为代表的体外核酸检测技术(nucleic acid test, NAT)因其简单、快速、安全等优点被广泛应用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体的快速检测和鉴定以及疾病的早期筛查与诊断中[7]。

但目前在 PCR及PCR衍生技术的实际操作中，仍有一些难以克服的困难，如非特异性扩增、甚至假阴性结果，导致NAT的灵敏度、特异性和准确性差[8-9]，这时往往需要添加一些外部物质来提高NAT的灵敏度、特异性和准确性，而这类物质统称为PCR增强剂(PCR enhancers)。现在很多公司也相继开发出相关PCR增强剂产品，如PCRx Enhancer System (Thermo Fisher Scientific)、 AmpFLSTRTMPCR Enhancer(Thermo Fisher Scientific)、MasterAmpTM10X PCR Enhancer(Epicentre)、PCR Enhancer(庄盟)。PCR增强剂作为一种核酸扩增优化的方式越来越被人们所认可，这种新技术进一步推动了以PCR为基础的各种检测方法的广泛应用，对于核酸检测中的应用“瓶颈”得到了一定程度的解决，并提高了潜伏期的病原体检测的检出限。

1 以PCR为基础的核酸检测技术

PCR作为分子生物学领域最重要的技术，其允许在不同的DNA序列(例如总基因组DNA)中选择性地扩增特定的目标DNA序列[10]。DNA分子的拷贝数在每一个扩展步骤中加倍最终产生数百万拷贝，因此PCR技术最早被开发用于病原体的检测和亚型鉴定，如今以PCR为基础而衍生出来的各类PCR技术因高通量、核酸定量、快速等特点也渐渐成为核酸检测的主流。

迄今为止，PCR衍生出的核酸检测技术主要有实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、巢式PCR、数字PCR(digital PCR，dPCR)。RT-PCR使用荧光染料将扩增和检测结合起来，依赖于扩增过程中产生的荧光信号定量分析[11]]。RT-PCR检测方法已经用于病原体的检测，成功对利什曼原虫[12]、B族链球菌(group BStreptococcus，GBS)[13]、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus，CHIKV)[14]等进行鉴定。RT-PCR相较于常规PCR交叉污染显著降低，但RT-PCR最大的问题是标准曲线重复性差，定量范围有限。巢式PCR又称为多重PCR，实现了对未知病原体或多种病原体的一次快速检测[15]。已有报道利用巢式PCR技术来对447个临床样品中细菌脑膜炎易染病原体检测，约3 h就可得到临床结果，而微生物培养法需3～7 d[16-17]。多重PCR技术价格低廉、灵敏度高、特异性强，可检测少量DNA样品，但多个引物间的配对、相互竞争等均会影响扩增效果，易出现非特异性扩增，需要对实验进行严密的设计。近年来，数字PCR(digital PCR, dPCR)作为一种新兴的核酸扩增检测技术以优异的检测灵敏性、特异性和重现性在核酸检测中越来越受到重视[18]，dPCR可敏感地检测脑脊液和外周血单核细胞样本中人体免疫缺陷病毒核酸[19-21]。dPCR不存在RT-PCR的标准曲线对结果有影响等问题[22]，但因其价格较高尚未广泛应用，在检测低拷贝基因时，dPCR的灵敏性低也成为核酸检测的限制。

目前，常规PCR已经成为最普及使用的核酸检测方法；在单基因检测上RT-PCR也得到应用；dPCR也是目前最灵敏、最高通量的检测方案，实现了同时对多位点基因检测筛选；同时开发出各种新型核酸检测技术如滚环扩增(rolling-circle amplification，RCA)、基因芯片以满足更加灵敏、特异、快速、高通量、低成本的检测需求。

2 核酸检测技术存在的问题

在核酸检测的应用中，利用PCR及其衍生技术直接诊断需要高水平的敏感性和特异性，检测的实际情况往往达不到要求，经常出现如下状况。①灵敏度低。对于早期疫病的诊断，这时标本中病原体的核酸量是极少的，PCR可检测pg级别的核酸，但有时DNA含量可能极低且不足以进行PCR，造成了检测的敏感度较低。②特异性差。检测中的实验结果经常出现多个非特异性条带、条带弥散、假阳性或假阴性结果，这时特异性差可能是由模板造成的。一方面，用于PCR的DNA样本往往不是DNA扩增的最佳来源，样本中存在PCR抑制剂[23-24]，而纯化过程可能导致目标DNA的丢失，费时费力，增加成本，涉及到多个样本的操作还会增加交叉污染的风险；另一方面，DNA的模板也常含有GC含量高的序列[25]，退火时单链 DNA 容易形成局部二级结构或发夹结构[26]，并可能导致DNA聚合酶扩增提前停止，或者模板序列高度重复序列、同源重组序列，这些情况都会造成DNA扩增失败，严重影响核酸的特异性正确检测。③保真度低。PCR的保真度往往与DNA聚合酶有关，最常用的TaqDNA聚合酶的错误率为(2.7×10-4)±(0.8×10-4)，现在市面上出现了价格昂贵的高保真PhuDNA聚合酶、KodDNA聚合酶使得保真度进一步提高，但在扩增长的片段(>10 kb)时，错配率升高，持续合成能力降低。在基于PCR的病原体诊断中，这些缺陷会成为障碍，需要对PCR技术优化，而PCR增强剂是一种有可能绕过这些限制的优化方法。

3 PCR增强剂在以PCR为基础核酸检测中的研究及应用

PCR增强剂是可以改善PCR及PCR衍生技术的灵敏度、特异性、保真度等的一类添加剂，可以显著改善假阳性、假阴性或无法扩增等情况，使准确度提高，检测的最低检出限提高，甚至当调整循环数、镁离子、引物、dNTP、DNA聚合酶和DNA模板浓度等优化方案无法解决问题时，能够提出一种更有效的策略，这种策略突破了原有检测技术的缺陷，对于病原体正确、快速的诊断具有重要意义。目前关于PCR增强剂存在很多类型，不同类型的PCR增强剂也针对不同核酸扩增问题提出了一定的解决方案。

3.1 小分子化学类PCR增强剂

小分子化学类PCR增强剂是最早出现的增强剂，其中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[27]和n，n，n-三甲基甘氨酸(又称甜菜碱)[28]是最常用的增强剂。DMSO经常作为PCR标准扩增优化的一部分；甜菜碱作为渗透保护剂，与甘油的功能类似，可以防止DNA聚合酶变性，QIAGEN和Clontech公司PCR增强剂产品也被证明含有甜菜碱[29]。如今也发现了更多化学物质有此作用，在PCR扩增中加入多种增强剂来提高PCR产物的产率、特异性和一致性，这其中包括甲酰胺、甘油、四甲基氯化铵等[30]，这些添加剂都对PCR及相关PCR技术扩增产生了有益的影响，而复合型PCR增强剂是将多种PCR增强剂按一定比例混合而成的一种新型PCR增强剂，对PCR的促进效率更高。如利用甘油、甲酰胺、DMSO和甜菜碱的PCR增强剂组合对含高GC的伪狂犬病毒进行PCR，使得之前无法扩增的PCR可以扩增，并且错配率有了明显的降低[31]。Horkov等[32]在含有PCR抑制物(如肝素、血红蛋白)的全血中扩增基因片段，通过不同增强剂组合发现1，2-丙二醇和海藻糖组合可以强而特异地进行RT-PCR。其中，海藻糖可通过保护酶免受血液抑制剂的干扰而起作用；1，2-丙二醇可以降低dsDNA片段的退火温度扩增富含GC的模板，为粗血样中富含GC核酸的RT-PCR提供了一种通用增强剂，并且在不同荧光探针中也可以使用。

小分子化学PCR增强剂在商业上容易获得且价格低廉，商业化PCR增强剂也多是以小分子化学物质作为主要成分，这些添加剂虽然可以提高PCR反应的产率、特异性、保真度，但它们对DNA解链温度的影响改变了特定引物模板体系的最佳退火温度，因此可能需要对热循环参数进行优化。同时，因不能预测哪种试剂可能对特定的目标有用，所以需要测试几种不同的添加剂。

3.2 纳米材料类PCR增强剂

随着纳米技术的出现，纳米材料由于其大的表面积和体积比、表面电荷密度和良好的热导率等优异的物理化学特性以及与单链DNA或蛋白质结合的特点常用来辅助PCR，这种方法被称为纳米-聚合酶链式反应(nano-PCR)。迄今为止，各种纳米系统已被报道用于增强PCR反应[33-37]，例如金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)、氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、量子点(quantum dots,QDs)、上转换纳米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)、碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)以及其他金属纳米粒子和纳米复合材料。2005年上海交通大学学者首次利用AuNPs改善了易出错的两轮PCR，并抑制了多重PCR的非特异性扩增，与化学类PCR增强剂不同，添加AuNPs即使在非最佳退火温度下也能获得一个单一的产物带[38]。目前，基于AgNPS建立了一种检测和鉴别野生型和基因缺失型伪狂犬病毒的分析方法，检测灵敏度比常规PCR提高了100～1 000 倍[39]。AgNPS也第一次被应用于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的快速临床检测，最低检出限为2.7×10-6ng·μL-1PEDV[40]。Cui[41]首次报道了CNTs在PCR中的促进作用，即使在不含Mg2+参与的PCR反应情况下也获得了相似结果。

纳米材料不仅可以作为PCR的添加剂，同样也是新型PCR技术的主要载体，纳米材料可应用于PCR可视化检测、芯片检测、生物传感器。Wang等[42]筛选出2种材料MoS2、WS2以增强SYBR GreenⅠ探针的RT-PCR反应信号，结果表明视觉检测的灵敏度可与实时检测结果媲美，同时MoS2、WS2还能抑制非特异性扩增。在基因芯片检测方面，加入Fe3O4纳米粒子可使PCR产率提高190%[43]，利用Fe3O4磁性还可快速去除纳米材料。

纳米材料作为一种生物相容性良好的材料，即使在较低的退火温度下，也能提高PCR扩增的特异性和灵敏性，而化学类PCR增强剂往往需要调整Tm值。纳米材料的优良导热性是PCR优化的基础，可以快速地提高或降低反应温度，缩短反应时间，以实现病原体的更快速诊断，对疾病控制具有重要意义。但目前在市场上并没有纳米材料PCR增强剂相关商品开发，纳米材料复合添加剂的研究也鲜有报道，已有报道称使用TiO2NPs-AgNPs用于空气中细菌气溶胶的检测，扩增效果明显优于单一纳米类PCR增强剂[44]，未来可针对复合型的纳米PCR增强剂的研制进一步研究。

纳米材料浓度和大小对PCR及衍生技术的扩增也有影响，低浓度的纳米粒子抑制长片段的扩增，高浓度的纳米粒子抑制小片段的扩增，因此在使用时要控制浓度范围。纳米材料辅助PCR的另一个问题是如何将纳米材料从PCR中分离出来，如低于20 nm AgNPs分离需要相当大的离心力，且长时间才使其沉淀，凝胶纯化法是从溶液中去除纳米材料的一种选择，但对于多个克隆或测序的下游应用来说不是有效的方案。未来的纳米材料可采用涂层或集成PCR管，而不是将纳米材料与试剂混合，这种方法可以解决PCR产物与纳米材料分离的问题。因此，纳米材料作为一种廉价、高稳定性的物质，在未来的PCR及其衍生技术上有很大的应用潜力。

3.3 蛋白质类PCR增强剂

在体内的核酸扩增过程中，单链结合蛋白(single-stranded DNA-binding proteins，SSBs)以非特异性的方式与单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)结合，保护瞬时形成的ssDNA免受核酸酶的攻击，并防止二级结构的形成，在DNA复制、重组和修复过程中起重要作用。关于体外核酸扩增的生物类PCR增强剂的研究中，人们也将目光转向了SSBs，与体内SSBs不同之处在于用于为核酸检测的SSBs必须具有耐热性质，2003年Perales等[45]从一嗜热杆菌中分离纯化出耐热的TthSSB，在PCR过程中添加TthSSB，提高了DNA扩增的效率和保真度，并使延伸时间缩短。随后2009年Mikawa等[46]发现使用TthSSB可使RCA中的非特异性DNA产物消除。在蛋白质类PCR增强剂研究中，T4 基因的32蛋白(GP32)也是一种单链DNA结合蛋白[47]，在促进PCR方面有一定的作用。本实验室也在DNA结合蛋白的基础上第一次发现了双链DNA结合蛋白组蛋白样蛋白(HU)也具有PCR、RCA增强作用，HU不仅像SSB、GP32结合ssDNA，对dsDNA也有结合，这就意味着HU在PCR中有着不同的作用机制，同时实验证明HU还能抑制非特异性片段的扩增，在实际应用中发现它比SSB有更优异的促进作用[48]。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)也是常用的PCR增强剂[49]，具有较高的赖氨酸含量，可与酚类化合物和多糖结合，避免聚合酶失活。在血液、粪便和肉的核酸检测中PCR抑制剂的存在常使DNA聚合酶失活，BSA的存在降低了抑制物的抑制作用，且老化和降解样品DNA含量较低，BSA提高了PCR敏感性。在急性气性咽炎的诊断中，添加12 mg·mL-1BSA、40 mg·mL-1PEG 400、0.5% Tween 20为RT-PCR开发了一种更经济、准确的检测方法[50]。在防止引物二聚体形成方面，牛凝血酶(bovine thrombin，BT)具有独特的效果，通过对人基因组DNA和乙型肝炎病毒基因组DNA的检测，证实了BT的PCR增强作用。此外，BT还能够有效减轻高浓度的纳米材料(例如AuNPs和GO)所引起的PCR抑制作用，与最受欢迎的PCR增强剂BSA相比，要达到相同的PCR增强水平BT比BSA所需的浓度低18～178倍[51]。

在复杂的样品中，蛋白质类PCR增强剂常作为一种DNA聚合酶保护剂，不影响PCR的退火温度，在以PCR为基础的核酸检测中可能通过模仿体内的复制过程提高灵敏度、特异性，与其他类型的PCR增强剂联合使用，更在一定程度上改善其他增强剂引起的高浓度抑制的现象，但蛋白质类PCR增强剂添加过多也会产生抑制。蛋白质类PCR增强剂的生产制备成本高且不宜于保藏，仅BSA因价格低廉成为目前最常用的蛋白质类PCR增强剂。由于复杂的PCR扩增过程，蛋白质类PCR增强剂促进的机理也尚在研究中。

3.4 其他类PCR增强剂

除了小分子化学、纳米、蛋白质类PCR增强剂，其他类型如元素混合物、核酸类化合物7-去氮-dGTP(7-deaza-dGTP)[52]、高聚物聚乙二醇等在核酸检测中也具有PCR促进作用。将固体元素混合物金、钛、镍、铋、锑加入多重PCR，可提高PCR的特异性、产率，缩短反应时间。此外，7-去氮-dGTP是一种dGTP类似物[53]，在低GC含量(5%～15%)和高GC含量(81%～90%)的模板中明显提高扩增，克服了其他类型的PCR增强剂在高AT模板难于检测的困难。最近，dPCR中添加7-去氮-dGTP有效检测了皮肤黑色素瘤的端粒酶逆转录酶启动子(GC>80%)[54]，而使用DMSO作为增强剂无PCR产物。这些增强剂在检测中并不常用，但它们具有特殊的性质，往往可以解决其他增强剂无法克服的困难。

4 PCR增强剂的优化机理

目前关于PCR增强剂的优化机理并没有确切的说法，但根据PCR增强剂的性质提出以下可能机制：①能以某种方式模拟体内SSBs的功能，与ssDNA结合，从而使引物与模板之间的错配最小化；②能够与DNA模板或DNA聚合酶发生强烈的相互作用或结合，从而显著提高聚合酶或DNA模板的局部浓度，大大提高PCR的特异性和效率；③提高模板与引物之间的特异性结合，降低非特异性或涂片产物形成的机率。不同物质的PCR增强剂因性质不同，这3种机制可能同时起作用，也可能单独起作用。此外，一些物质还具有特殊的性质，如纳米材料具有良好的热导性可以降低退火温度，蛋白质类PCR增强剂HU因本身可以与dsDNA结合，在PCR扩增过程中的机理更为复杂。关于PCR增强剂的作用机理可通过高分辨率透射电镜、毛细管电泳-激光诱导荧光偏振等技术进一步研究，为实际应用提供理论基础。

5 展望

2019年12月爆发的新型冠状病毒公共健康危机激起了人们对流行病检测的关注，而近年来的病原体检测中，依靠PCR增强剂使核酸检测更加敏感、准确、快速地进行诊断，在传染病防控、遗传病诊断、农业转基因作物鉴定、法医学分析等领域中建立了一种新型、适用性广、快速的检测系统，在大片段基因合成中PCR增强剂也可起到优化作用。目前，市售PCR增强剂价格昂贵、具有未知的成分及难以调节单个组分的浓度[55]，同时对PCR体系所使用的酶也有所限制，使得产品在基础检验领域并未广泛适用。本文对目前最常用、最新的PCR增强剂进行了总结，对一些病原体核酸检测的缺陷也提出了解决策略，未来可针对高爆发的流行病利用一种或几种PCR增强剂研制PCR及相关衍生技术试剂盒，这对流行病大爆发时核酸的快速、准确检测具有重要意义。

如今也发现纳米材料不仅作为PCR增强剂发挥作用，纳米材料也是可视化、基因芯片检测、生物传感器等PCR新型技术的重要载体，在未来核酸检测领域有望开发出集特异性、敏感性、准确性为一体的新型检测技术。化学类、纳米类、蛋白质类及其他类PCR增强剂在核酸检测中都可提高检测灵敏性、特异性、产率，但PCR增强剂的使用也存在缺点，PCR增强剂的浓度和添加量需要在一定的范围内才起到有益的促进作用，添加超出或少于此范围时会起到抑制作用，同时由于每个样本的模板、实验仪器、场所等情况不同，因此在不同的核酸检测中只能通过大量实验或已有研究添加，不能预测实际情况，所以未来还需开发更加稳定、廉价、应用范围广的PCR增强剂以克服核酸检测缺陷的新型核酸检测技术。