南瓜属作物遗传转化研究进展

韩涛 姜立娜 郭卫丽 周俊国 陈学进

摘 要：南瓜属（Cucurbita）作物包括中国南瓜（C. moschata D.）、印度南瓜（C. maxima D.）和美洲南瓜（C. pepo L.）等许多重要蔬菜，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。目前，南瓜属作物遗传转化技术普遍存在转化效率低、重复性差、假阳性和嵌合体干扰等诸多问题。随着分子生物学的迅猛发展，南瓜属作物遗传改良和基因功能验证亟需建立高效稳定的遗传转化体系。前人在南瓜离体再生、花粉管通道和农杆菌介导等转化方法上做过不少探索，普遍认为以农杆菌介导的子叶节离体再生是最具潜力的转化体系。笔者对现有的研究基础进行综述， 为促进其在南瓜属作物遗传改良上的应用提供参考。

关键词：南瓜属;花粉管通道法;农杆菌;转基因;离体再生

中图分类号：S642.1   文献标志码：A   文章编号：1673-2871（2020）01-001-06

Abstract： Cucurbita crop includes many important vegetables， such as C. moschata D.， C. maxima D. and C. pepo L.， which are widely cultivated worldwide and have important economic values. At present， there are many problems of genetic transformation in Cucurbita， such as low efficiency， poor repeatbility， and interference of false-positive and chimeric. As the rapid development of molecular biology， it is urgent to establish an efficient and stable genetic transformation system for genetic improvement and gene function verification. Many researches have been conducted on the methods of pumpkin regeneration in vitro， pollen tube pathway and Agrobacterium-mediated transformation. It is generally believed that Agrobacterium-mediated cotyledon node regeneration is the most potential transformation system. Here we summarize the research progress in this field， providing references to promote its application in the genetic improvement of Cucurbita crops.

Key words： Cucurbita; Pollen tube mediated gene transfer; Agrobacterium; Transgenesis; Regeneration in vitro

南瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita）的重要蔬菜，包括5个主要栽培种，分别为：中国南瓜（C. moschata D.），印度南瓜（C. maxima D.），美洲南瓜（C. pepo L.），黑籽南瓜（C. ficifolia B.）和灰籽南瓜（C. mixta P.）[1]。南瓜起源于中南美洲，栽培历史悠久，世界各地均有种植，具有重要的经济价值。南瓜果实营养丰富，富含多种维生素、氨基酸和矿物质，种子含有多种保健活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、提高肌体免疫力等功效[2]。由于南瓜植株抗逆性较强，常作为其他瓜类蔬菜的砧木，用于提高嫁接苗的抗逆性、产量及果实品质[3-4]。

植物遗传转化（转基因技术）是指将外源基因（目的基因）经过体外重组，通过种质系统转化或组织培养将目的基因整合于基因组，使植物获得新的性状并能稳定遗传的一系列技术[5]。遗传转化是植物性状改良的重要手段，相对于传统杂交方法具有不可比拟的优势，如能有效克服物种间的界限、改良性状方向精准、育种进程短等。植物遗传转化的方法主要有花粉管通道法、农杆菌介导法和基因枪法等。

南瓜遗传转化体系的探索起步比较晚，普遍存在转化效率低、可重复性差等问题。随着南瓜属作物基因组序列的公布[6]，南瓜基因功能研究将进入后基因组时代，遗传改良也将迈上新台阶，然而低效的遗传转化成为南瓜性状改良和基因功能研究的主要瓶颈，因而建立高效稳定的南瓜遗传转化體系非常迫切。关于南瓜遗传转化详尽的文献综述还未见报道，笔者根据现有的研究基础，对不同的遗传转化方法进行综述，总结技术难点，分析潜在的突破口，为建立高效稳定的南瓜遗传转化体系提供有力支持。

1 花粉管通道法

花粉管通道法（Pollen Tube Mediated Gene Transfer，简称PTT）是由我国学者周光宇等创立[7-8]，后经不断改进而建立的一种转化技术。基本原理是利用受精卵发育初期易接受外源DNA分子的特点，以花粉萌发形成的花粉管为通道，将外源基因或含有外源基因的质粒或农杆菌通过柱头涂抹、子房注入等方法使目的基因整合到受体细胞基因组中，随着受精卵的发育而获得转化植株。也有学者将该方法经过改进后称之为子房注射法[9]。花粉管通道法借助植物自身受精卵发育形成转化植株，因此不依赖组织培养，技术简单，成本低，已得到分子生物学验证。该法在玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、甜瓜（Cucumis melo）、西瓜（Citrullus lanatus）等多种作物上获得成功[10]。利用花粉管通道法进行南瓜遗传转化的探索非常有限。张言朝等[11]采用子房注射法尝试了南瓜转化遗传，南瓜授粉后24 h，向子房注射含目的基因的质粒，收获115个果实，选取56个果实的种子，幼苗经过PCR鉴定得到7个阳性植株，T1代经过鉴定并未得到纯合的转基因植株，转化率仅为0.25%。转化效率低，随机性大，该方法能否再次获得成功未见后续报道。2017年，中国农业科学院研发了一项新的基于花粉管通道的遗传转化技术，以磁性纳米颗粒Fe3O4作为基因载体，在外加磁场作用下将载体颗粒输送至花粉内部，用该花粉进行人工授粉直接获得转化种子，再经过筛选获得稳定遗传的转基因后代。该法在两种棉花（Gossypium hirsutum）基因型中获得了0.18%～1.00%的转化率，在辣椒、百合、中国南瓜和美洲南瓜中尝试，成功获得了辣椒和中国南瓜的转基因后代，但研究人员未说明转化率[12]。该技术作为一种新的尝试，可能具有广泛的应用前景。

利用植物自然受精过程进行遗传转化的方法还有蘸花法（Floral-dip Method），该法配合使用农杆菌，操作非常简单，但转化效率低，适合种子较多的植物，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和其他部分植物中得到广泛应用[13-15]，该法并不适合大多数植物，尤其是株型大、种子少的植物，后期筛选转基因阳性植株将费时费力。南瓜株型大，雌花子房大且壁厚，通过蘸花使农杆菌渗透到受精卵的可能性极小，因此笔者推测该法并不适合南瓜。

尽管花粉管通道法简便，但并未成为南瓜遗传转化的主流方法，笔者认为可能的原因是其转化机制尚不清楚，可重复性差，易受田间环境因素和花期影响，转化效率低等。

2 农杆菌介导法

植物遗传转化中农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated Gene Transfer）應用最为广泛，几乎所有的双子叶植物和部分单子叶植物都适用。作为天然的转化系统，该法具有单拷贝整合、转化基因片段大、转化效率高、遗传稳定（符合孟德尔遗传）、较少发生基因沉默、可重复性较好等优势。农杆菌介导法已经在葡萄（Vitis vinifera）、矮牵牛（Petunia hybrida）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivuml）、番茄（Solanum lycopersicum）、黄瓜（Cucumis sativus）等诸多植物中获得成功[16-20]，成为植物遗传转化的主流方法。在南瓜遗传转化方面，前人的探索几乎均采用农杆菌介导法。南瓜的离体再生、南瓜基因型和外植体的选择、农杆菌菌株的选择、筛选剂的选择、侵染方法、脱菌方法和生长调节剂的使用等都会影响转化效率，笔者就从这几个方面进行论述。

2.1 南瓜的离体再生

高效稳定的离体再生体系是农杆菌介导法遗传转化的前提。和大多数植物一样，南瓜有体细胞胚发生（Somatic embyogenesis）和器官发生（Organogenesis）两种再生途径。关于体细胞胚发生途径前人做过很多研究，且多以美洲南瓜为试材。早在1995年，Carol Gonsalves等[21]就以子叶为外植体，经过诱导培养11～17周后，6种美洲南瓜（又称西葫芦）基因型均诱导出体细胞胚并获得再生苗。谢冰等[22]培养美洲南瓜未受精的胚珠，获得了雌核发育的再生植株。但体细胞胚诱导效率并不高，因此前人探索了不同的处理方法，如热激处理，改变培养基的pH及渗透压，改变生长调节类物质种类和浓度等[23-25]。相对于体细胞胚发生途径，器官发生途径频率高、周期短。一般植物器官发生途径既可以先诱导愈伤组织，也可直接诱导不定芽，然后生根培养。南瓜属作物通过愈伤组织诱导不定芽非常困难，目前还未见文献报道。因此，南瓜属作物器官发生途径均采用外植体直接诱导不定芽的方法。前人从外植体来源[26-27]、生长调节物质的种类和浓度[28-29]等方面做过不少探索，南瓜的胚轴、胚根和叶片很难诱导出不定芽[28，30]，子叶节（带基部的子叶）因再生率较高而成为广泛使用的外植体。赵建萍等[28]认为子叶基部临近下胚轴的切口处才能诱导出不定芽。Kathiravan等[31]以子叶节为外植体，对15个美洲南瓜种质资源进行不定芽诱导，均获得了再生，再生率为56%～94%，只有1个种质为22%。Cheng等[32]也是利用子叶节诱导不定芽，成功获得美洲南瓜双单倍体再生植株。一些印度南瓜基因型也通过子叶节诱导不定芽获得了再生植株，再生率较高[33-36]。Gisbert[37]对几种南瓜属作物种质进行离体再生，通过子叶节诱导再生芽，3种美洲南瓜、2种黑籽南瓜、1种印度南瓜和2种中国南瓜均获得了再生植株。日本学者通过诱导子叶节在14份包括美洲南瓜、印度南瓜、黑籽南瓜和中国南瓜种质中均获得了再生苗，再生率为38%～76%[38]。不定芽诱导过程中使用最多的是细胞分裂素，前人探索过不同激素的配比和浓度[36，39]，筛选出很多最优组合。不定芽诱导成功后还要经过芽伸长、诱导生根和驯化移栽等过程。当芽不易自然伸长时，多添加赤霉素GA3诱导[39]。多数基因型在不含激素的1/2 MS培养基上可正常生根[38]，添加生长素类激素可促进生根。总体来说，不定芽生根和组培苗驯化移栽比较容易。

综合分析，高效稳定的南瓜离体再生仍然存在一定困难，主要体现在体细胞胚再生困难且周期长，愈伤组织几乎不会再分化[36]，子房或胚珠培养再生率低。目前，以子叶节为外植体进行离体再生是最成熟的方法，许多南瓜属作物的不同基因型均获得了较高的再生率，说明以子叶节为外植体的器官直接再生途径对南瓜属作物具有普适性，该法成为南瓜遗传转化的基础。

2.2 南瓜基因型和外植体对转化的影响

不同南瓜基因型对农杆菌介导的遗传转化有较大影响，可能是它们对农杆菌的敏感性不同。根据Nanasato[38]的研究结果，使用同一种农杆菌菌株EHA105，不同基因型南瓜的转化效率最低为0%，最高可达到9.2%。在外植体选择方面，子叶节最为常用。前人在子叶节取材时间、子叶节的状态等方面做了不少探索。白婧等[39]认为印度南瓜‘金辉一号2片子叶直立、呈绿色时取材最佳，过早过晚均会降低转化率。黑籽南瓜培养4 d的种子取子叶节最好[40]。张玉园[35]认为印度南瓜‘北观在子叶微展、呈黄绿色时为最佳的取材时间。日本学者Nanasato[41]对中国南瓜子叶节的取材时间为种子在28 ℃下萌发1 d、胚根刚长出时。由此可见，子叶节的状态对转化成功与否至关重要。笔者分析可能的原因：一方面是子叶节近轴端芽的再生能力与其状态密切相关;另一方面是取子叶节时切割的伤口是农杆菌侵染的入口，如果伤口距离有再生能力的细胞较远，则农杆菌难以到达。子叶生长时间不同，具有再生能力细胞的位置也有所变化，所以子叶的状态很重要。除了子叶节，有文献报道南瓜茎尖转化成功的例子，Shah等[42]以茎尖为外植体进行美洲南瓜遗传转化，成功获得了转nptII和cbf1基因的阳性植株，转化效率0.7%，这说明茎尖也存在再生和被转化的潜力。

2.3 农杆菌对转化的影响

农杆菌是生长在土壤中的一种革兰氏阴性细菌，包括两种主要类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes），分別含有Ti质粒和Ri质粒。在农杆菌侵染植物的过程中，质粒上的T-DNA区可整合于植物基因组而完成转化[43]。很早以前，研究人员就证实了农杆菌对南瓜的可侵染性和转化的可能性，Katavi[c][']等[44]使用野生型8196和15834两种发根农杆菌菌株尝试转化美洲南瓜，菌株8196可以使子叶诱导发根，经过比较，诱导的根系和正常的南瓜根系在生理上存在很大不同。Toppi等[45]证明发根农杆菌菌株、植株年龄和侵染时间均会影响美洲南瓜的转化。在尝试印度南瓜转化时，Francisco等[46]的研究结果表明，根癌农杆菌和发根农杆菌对瞬时转化效率的影响不大。目前，得到广泛应用的农杆菌工程菌株大多为根癌农杆菌（如EHA101、EHA105、LBA4404、GV3301等）。前人研究发现，不同菌株的侵染能力有所不同[47]，对离体再生也有影响[5]，因此选择合适的菌株对南瓜遗传转化可能是个关键因素。

农杆菌的生长状态和活力对侵染效率有较大影响。一般-80 ℃保存的农杆菌要进行1～2次活化，达到对数生长期的活力最佳。不同于大肠杆菌（Escherichia coli），质粒在农杆菌中的拷贝数不多，因此先挑取单菌落，再进行扩大培养以保证质粒的拷贝数。理论上菌液浓度越高、侵染时间越长越有利于侵染，但浓度过高、时间过长会引起外植体受害过度而死亡。因此，要选择合适的菌液浓度和侵染时间。在可参考的资料中，南瓜遗传转化菌液浓度OD600在0.1～0.8之间[35，39，41]，侵染时间5～40 min不等[35-36，41，48]。

Ti质粒上的vir基因对遗传转化至关重要，其表达产物调控T-DNA的剪切、包装、转移和整合。因此，提高vir基因的表达有利于提高转化效率。研究表明，温度、pH值、糖类、酚类化合物都会影响vir基因表达[49-50]。一般农杆菌的培养温度为28 ℃，培养基中添加蔗糖，pH为5.2，这个条件同样适用于南瓜[41]。

农杆菌具有趋化性，植物伤口处分泌的酚类物质会引诱农杆菌向伤口移动。因此，添加酚类物质有利于侵染，其中乙酰丁香酮因效果好而最为常用，其浓度一般为200～500 μmol·L-1[35，41]，另外菌液中添加MES缓冲液可以使农杆菌处在适宜的pH环境下。也有学者在侵染液中添加表面活性剂，如吐温20、Silwet L-77等[14]，表面活性剂有利于农杆菌在外植体表面附着，可能有利于转化。

2.4 转化方法的影响

转化方法是遗传转化的核心，以提高农杆菌与外植体侵染互作和高效的离体再生为原则。以南瓜子叶节为受体时，子叶节的切割方法不同，转化效率也不同。子叶节的切割应尽量使具有再生能力的细胞露于表面，以利于接触农杆菌。Nanasato[41]制备中国南瓜子叶节时经过横切和纵切，以保留子叶和下胚轴连接处的1/4子叶为外植体。张玉园[35]认为，印度南瓜子叶节横向和纵向均一切为二，转化效率最高。侵染前的预培养有利于转化，一般认为，预培养过程中添加的细胞分裂素可促进细胞分裂，代谢活跃，更有利于细胞接收外源基因。预培养的时间不宜过长，印度南瓜子叶节预培养的最佳时间是36 h[39]，Nanasato[41]认为中国南瓜子叶节经过24 h预培养最好。侵染过程一般采用菌液浸泡法，考虑到农杆菌侵染伤口的特点，不少学者通过造伤来增强侵染效果，造伤的方法包括超声波处理[51]、玻璃微珠处理[52]、刀片切割[53]和硼酸铝晶须处理[54-55]。另外，利用真空渗透处理可以减小农杆菌进入植物细胞的阻力[38]。大多数文献报道造伤提高了转化率，但造伤可能会影响外植体再生或降低外植体存活率。农杆菌从侵染开始到T-DNA整合完成需要大约2～3 d，这也是外植体和农杆菌的共培养时间，24～25 ℃黑暗环境是常用的培养条件。共培养时，Nanasato等[41]采用浸湿液体培养基的3层滤纸代替传统的固体琼脂培养基，在不影响转化效率的同时降低了农杆菌对外植体的伤害。T-DNA与基因组整合后，农杆菌的脱除也很重要，一旦长出肉眼可见的菌落将难以控制和脱除。一般先用脱菌剂浸泡，无菌水冲洗几遍后涂抹干燥，在培养基中也需要添加脱菌剂，脱菌剂有头孢霉素、羧苄青霉素以及新型抗生素美罗培南[41]。脱菌剂及其浓度的确定以抑菌效果好、对植物影响最小为原则。农杆菌侵染和造伤处理都会伤害外植体，所以在某些植物的遗传转化中，有学者在筛选前先进行恢复培养。笔者认为恢复培养可能也适用于南瓜，但恢复培养会增加假阳性植株，增加后期筛选的工作量。阳性植株的筛选方法取决于载体的抗性基因（如抗潮霉素、卡那霉素和除草剂基因）或报告基因（如GFP或GUS），前人采用适宜浓度的潮霉素筛选转基因黑籽南瓜[40]，利用GFP的荧光信号筛选中国南瓜阳性植株等[41]。

3 基因枪法

基因枪法（Biolistic Bombardment）转化植物的基本原理是高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，使目的基因进入受体细胞，进而完成基因的整合和表达，获得转化植株。基因枪法无宿主限制，受体可以是胚、愈伤组织和细胞悬浮液等，可控度高、操作简单。但该法获得的转基因后代容易出现突变、拷贝数多、容易发生基因沉默，还存在转化机制不清楚、仪器昂贵等问题。基因枪法应用面不及农杆菌介导法，在南瓜遗传转化上的应用也鲜有报道，李贞霞等[30]尝试基因枪法转化南瓜，以愈伤组织为受体，优化了试验条件，获得了表达GUS基因的愈伤组织，但并未获得转化植株。利用基因枪法进行南瓜遗传转化可能需要更深入的探索。

植物遗传转化方法还包括真空渗入法、PEG法和电穿孔法等，这些方法在南瓜上的应用未见文献报道。

4 存在问题与展望

高效稳定的南瓜遗传转化技术依然是个世界性难题，只有保证较高的转化效率、保证较好的重现性才具有实际应用价值。目前，广泛使用的农杆菌介导法仍存在不少困难，主要表现在两个方面：（1）缺乏稳定高效的适宜转化的再生体系。南瓜体细胞再生效率低，器官间接再生途径愈伤组织诱导芽困难。目前，只有以子叶节为外植体的器官直接再生途径可用，但这种途径获得的再生植株存在假阳性、嵌合体、筛选困难等问题，这些都是今后需要解决的关键问题。笔者推测，选择种子萌发早期（具有再生能力的细胞尚未分化）的子叶节可能有助于减少嵌合体和假阳性。（2）遗传转化效率低。转化过程受多种因素影响，如南瓜基因型、外植体状态、农杆菌菌株及其状态、转化方法等，其中的关键因素难以寻找，破解关键因素是提高转化效率的根本。外植体前处理、预培养、侵染方法等与遗传转化密切相关，也是今后应重点解决的关键问题。

近年来，生物技术发展迅猛，很多园艺植物通过基因工程获得了优异的农艺性状。南瓜作为葫芦科重要蔬菜作物，深受世界人民喜爱，但遗憾的是南瓜属作物受重视程度不高，分子生物学研究进展缓慢，遗传转化技术不够成熟。遗传转化不仅可应用于遗传改良，而且还是基因功能鉴定的有效途径。在南瓜遗传转化技术难以突破的情况下，有学者采用瞬时转化验证基因功能。瞬时转化不依赖组织培养，简单快捷，如Francisco等[46]开发了一种简便的印度南瓜瞬时转化的方法。遗传转化技术在南瓜上的应用将极大地促进南瓜产业的发展，从1995年至今，仅有两篇文献报道通过遗传转化成功获得了转基因抗病毒美洲南瓜[56-57]。南瓜遗传转化的应用任重道远，这需要更多的资金投入，更需要坚持不懈的努力。

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