慢性丙型肝炎患者血清miR-122、miR-222水平变化及其临床意义*

杨驭媒，刘小琦，李新丽，郑永利

(1.成都市第六人民医院检验科，四川成都 610051；2.四川省人民医院检验科，四川成都 610072；3.成都市公共卫生临床医疗中心，四川成都 610066)

慢性丙型肝炎(CHC)是临床常见的感染性疾病，其病理改变与乙型肝炎极为相似，包括肝细胞坏死和淋巴细胞浸润。随病情进展CHC患者可发生肝硬化，并且发生肝癌的风险增加[1]。丙型肝炎病毒(HCV)主要通过输血、针刺以及母婴等方式传播，目前国内抗病毒治疗方案仍以干扰素和利巴韦林联合用药为主，其疗效受病毒和宿主等多方面因素影响，因此需要一种安全、无创的方法来评估治疗效果和病情进展情况[2-3]。微小RNA(miR)是长度约20～25个核苷酸序列的非编码RNA，可以抑制靶基因mRNA的表达，从而参与细胞周期调控、胚胎发育及免疫预防等生理活动。最新的研究表明，miR在肝脏病理机制和生理功能的调控中有重要作用，其中miR-122和miR-222在病毒性肝炎患者中水平明显上调，可能参与了肝星形细胞(HSC)的活化和肝纤维化的进展，监测血清miR-122、miR-222水平变化对治疗和病情评估有重要参考价值[4-6]。本研究主要分析了CHC患者血清miR-122、miR-222水平及其与肝功能和肝组织病理改变的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2016年2月至2019年2月在成都市公共卫生医疗中心进行治疗的CHC患者共173例纳入研究作为CHC组，男95例、女78例，年龄19～57岁、平均(42.61±9.08)岁。纳入标准：(1)符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中CHC诊断标准[7]；(2)年龄18～60岁；(3)完成经皮肝组织穿刺活检；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)伴其他病毒性肝炎或HIV感染；(2)伴肝脏肿瘤、脂肪肝及胆汁淤积症等其他原发或继发性肝病；(3)此前6个月内曾行抗病毒或免疫调节治疗；(4)肝移植患者；(5)肝组织活检不符合标准者。另外，选取同期体检合格的健康者120例作为对照组，男71例、女59例，年龄18～60岁、平均(43.29±8.76)岁。两组人群年龄、性别等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血清学指标检测 采集上述两组人群空腹外周静脉血2管各3 mL，3 500 r/min离心5 min，取上清液-80 ℃保存备用，一管采用日立7600-020型全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、血清清蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)水平；一管采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)进行miR-122、miR-222水平的检测，试剂盒购自美国ABI公司。检测步骤：先用miRNAVana PARIS试剂盒(美国Ambion公司)提取和纯化miR，然后以特异性茎环引物(Applied Biosystems公司)将其反转录为cDNA并以此为模板进行PCR扩增，然后以miRNA-16为内参检测和计算miR-122及miR-222相对表达水平，所有操作均严格按照说明书要求完成。

1.2.2肝脏组织病理检查 通过彩色多普勒超声诊断系统(Philips HD7EX型)引导，经皮穿刺获取长度>1 cm的肝组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精染色后由3位经验丰富的病理医师根据《病毒性肝炎防治方案》进行阅片和诊断，肝炎活动度分级[8]：G0为无炎症；G1为汇管区炎症；G2为轻度汇管区周边碎屑样坏死(PN)或灶性坏死；G3为中度PN；G4为重度PN或桥样坏死。肝纤维化分期：S0为无纤维化；S1为扩大的汇管区纤维化；S2为汇管区周围纤维化但小叶结构保留；S3为纤维化伴小叶结构紊乱；S4为肝硬化。

2 结 果

2.1两组人群肝功能指标的比较 CHC组血清ALT、AST、GGT、ALP及TBIL水平均高于对照组，血清ALB水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2两组人群血清miR-122、miR-222水平的比较 CHC组血清miR-122和miR-222水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3不同肝炎活动度分级的CHC患者血清miR-122、miR-222水平比较 随着肝炎活动度分级增加，CHC患者血清miR-122和miR-222水平明显升高(P<0.05)，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 两组人群肝功能指标的比较

表2 两组人群血清miR-122、miR-222水平的比较

表3 不同肝炎活动度分级CHC患者血清miR-122、miR-222水平比较

注：与G0比较，aP<0.05；与G1比较，bP<0.05；与G2比较，cP<0.05；与G3比较，dP<0.05。

2.4不同肝纤维化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比较 随着肝纤维化分期增加，患者血清miR-122水平明显降低(P<0.05)，血清miR-222水平明显升高(P<0.05)，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同肝纤维化分期CHC患者血清miR-122、miR-222水平比较

注：与S0比较，aP<0.05；与S1比较，bP<0.05；与S2比较，cP<0.05；与S3比较，dP<0.05。

2.5miR-122、miR-222与肝功能、肝炎活动度及肝纤维化的相关性分析 血清miR-122水平与ALB和肝纤维化分期呈负相关性(P<0.05)，与肝炎活动度呈正相关性(P<0.05)；血清miR-222水平与ALT、ALB、肝炎活动度及肝纤维化分期均呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 miR-122、miR-222与肝功能、肝炎活动度及肝纤维化相关性分析

3 讨 论

CHC是世界范围内广泛流行的公共卫生问题，其发病率虽然低于慢性乙型肝炎，但近年来呈明显上升趋势。全球HCV感染率约为3%，感染者数量超过1.7亿，发展中国家占90%，其中55%～85%进展为慢性感染且5%～15%的患者可在感染20年后进展为肝硬化，威胁患者生命安全[9-10]。目前，肝病进展情况评价仍依赖于肝组织穿刺活检，对人体损伤较大，患者耐受性较差，难以重复开展，因此寻找非侵入性的肝组织损伤和纤维化评估方法用于动态监测肝脏病变进展，对临床诊断、治疗和预后评估均有重要意义[11]。

基因芯片技术研究表明HCV不仅可利用宿主细胞miR干扰靶基因表达而改变宿主环境，还可编码自身miR以促进生存和繁殖。同时，宿主也通过调节miR表达而产生抗病毒效应。miR-122是首个被证明与HCV复制紧密相关的miR，可参与调节多种肝脏疾病的发生和进展，现已成为肝脏活动性损伤和修复的重要标志物。miR-122对肝炎病毒复制和翻译具有促进作用，因此在病毒性肝炎患者血清中水平可出现不同程度增高[12-14]。miR-222与miR-122具有相同种子序列，两者靶基因约75%一致，故在病毒性肝炎患者中变化趋势相似。有研究报道miR-122和miR-222在CHC患者血清中表达水平均明显升高且对评价患者肝功能损伤可能具有较大的价值[5]。本研究显示，CHC患者血清miR-122和miR-222水平均高于健康人群，提示miR-122、miR-222与HCV感染关系密切。CHC患者血清miR-122和miR-222水平随肝炎活动度分级增加而升高。Spearman秩相关分析显示，miR-122与患者GGT水平和肝炎活动度分级呈正相关，miR-222与ALT和肝炎活动度分级呈正相关，这表明监测miR-122、miR-222水平变化可反映肝组织炎症水平，为CHC诊断和病情评估提供参考依据。

CHC随病情进展常导致肝组织损伤、坏死和纤维化。miR-122主要在肝脏组织中表达，肝纤维化早期表达水平较高，当肝脏损伤和纤维化加重时，其表达水平常出现明显下调，是肝纤维化评价常用的标志物[15]。PIROLA等[16]对四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠进行研究发现，miR-122水平随着肝纤维分期升高而降低。本研究显示，随着肝纤维化分期升高，CHC患者血清miR-122水平降低，两者呈负相关，与APPOURCHAUX等[6]研究结果一致，其原因主要为晚期肝纤维化患者正常肝细胞数目大幅度减少导致miR-122水平下降。HSC因炎症或机械损伤激活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化发生、发展的主要病理和生理过程。miR-222在HSC细胞中表达水平明显上调，可能参与肝纤维化过程的调节，同时有研究认为与肝纤维化早期比较，晚期乙肝患者肝组织miR-222表达水平明显升高[17-19]。本研究显示，CHC患者血清miR-222水平随肝纤维化分期升高明显增加，两者呈正相关，可见肝纤维化患者miR-122和miR-222表达水平变化趋势相反。其原因为miR-122主要由肝细胞释放，故在病毒性肝炎等疾病导致肝细胞活动增强时表达增加，在肝细胞数量减少的肝纤维化等病变中表达减少。miR-222在HSC细胞中表达，在肝组织炎症和纤维化时表达水平均明显增加。因此，联合检测miR-122和miR-222可用于判断肝脏病变的类型及其严重程度，而且有助于减少对穿刺活检的依赖，可以为CHC患者病情监测和预后判断提供参考。

4 结 论

CHC患者血清miR-122和miR-222水平均明显升高。其中miR-122水平随肝纤维化分期增加而下降；miR-222表达水平则随肝纤维化分期增加而升高。检测血清miR-122和miR-222表达水平，可为CHC病情监测和预后评估提供客观参考依据，但若要进入临床应用尚需更多研究定量分析其预测价值。