不同程度冠状动脉粥样硬化病变下心肌组织中melusin的表达研究*

李 竹， 万昌武， 于燕妮， 黄 江， 夏 冰， 汪元河， 汪家文， 王 杰

(贵州医科大学法医学院， 贵州 贵阳 550004)

冠心病(coronary heart disease, CHD)指因冠状血管病变导致心肌供血不足而引起的缺血性心脏病，是由于冠状动脉病变导致血管结构性或功能性狭窄，使心肌供血不足，从而引起一系列心脏代谢、功能及结构的紊乱疾病。研究表明，CHD是心血管系统疾病中发病率最高的疾病，也是导致猝死最常见的疾病，对人类健康及生命构成了极大危害[1]。melusin蛋白是一种特异性的肌肉组织蛋白，属于黏附分子的一员，其具有独特的结构域，不仅介导了细胞与细胞外基质及其细胞自身的黏附，还参与了细胞的信号转导与活化等重要的生理病理过程(生长、分化、炎症反应及创伤修复等)[2]。研究表明，melusin在血管平滑肌细胞特别是在斑块内微血管中存在，对冠状动脉粥样硬化中血管的形成具有显著的调节作用[3-4]。动物实验也证实，在动脉粥样硬化早期，melusin的高表达可以引起粥样斑块的生长；同时其能帮助平滑肌细胞浸润血管内膜从而促进新生血管的生成，在动脉粥样硬化晚期可以防止斑块破裂、出血[5]。在小鼠的左前降支冠状动脉结扎模型中，melusin的表达发挥了重要的保护作用，不仅减少了炎症细胞的浸润，还改善了缺血远端的冠脉痉挛及心肌组织的缺血状态，有效防止了心脏破裂[6-7]。有研究报道，在动脉粥样硬化患者的心肌中，melusin的蛋白及mRNA表达量较正常实验者显著降低[8-9]。由此可见，melusin作为一种保护性因子，参与了心血管系统疾病的发生，在冠状动脉疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥了重要的作用。但上述研究结果来源仅限于动物模型、血清学等层面，关于直接检测人体心脏组织中melusin表达的报道较为罕见。

本研究旨在通过收集法医鉴定中冠心病案例，检测心肌组织中melusin蛋白的表达水平，分析其在不同程度冠状动脉粥样硬化病变下的改变情况，探讨melusin表达与冠心病发生发展的关系，为冠心病的早期预防和治疗提供更为充分的实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验材料收集

根据卫生部颁布的《解剖尸体规则》并获得了贵州医科大学伦理委员会的认可(伦审批件号：2018-60-01)，提取了贵州医科大学法医司法鉴定中心2014年5月～2018年10月经尸体解剖检验的人体冠状动脉及心脏组织样本，主要为左心室肌实验组和对照组。实验组案例纳入标准：(1)纳入的案例为常温保存1 d或冰冻保存3 d以内(后于室温解冻24 h)者；(2)经组织病理学检查确认存在冠心病病变：①冠状动脉管壁内膜增厚、管腔变窄，增厚的冠脉内膜见粥样斑块形成，存在或不存在继发病变(粥样斑块破裂、斑块内出血、动脉瘤形成等)；②合并心肌病变(心肌纤维化、心肌梗死等)；(3)冠状动脉粥样硬化伴有或不伴有心肌缺血改变；(4)冠心病伴有或无心脏肥大；(5)按WHO规定，猝死是指从症状发作至死亡时间在24 h内。实验组案例排除标准：(1)组织自溶、腐败，结构不清的病例；(2)尸体检验及组织病理学检查证实有风湿性心脏病、心肌病、心肌炎等病变；(3)具有恶病质或多器官功能障碍及全身感染性炎症的病例。对照案例纳入标准：(1)纳入的案例为常温保存1 d或冰冻保存3 d以内(后于室温解冻24 h)者；(2)死亡原因明确为意外高坠、机械性窒息死亡或溺死且无冠状血管及心肌组织病变。排除标准同实验组。

根据上述纳排标准，对照案例选取无病变的冠状动脉前降支及左心室肌；实验组选取肉眼所见的冠状动脉粥样硬化病变最重(狭窄最重)血管段，经组织学检查证实为粥样硬化病变的案例，同时提取案例对应的左心室肌组织。所取组织均以4%中性甲醛液固定供HE染色和免疫组织化学(immunohistochemical staining，IHC)染色，其中部分心肌组织置于-80 ℃冰箱冻存供Western blot及real-time PCR检测。

2 主要仪器与试剂

兔抗人melusin单克隆抗体(GeneTex)；兔抗人β-actin单克隆抗体(Bioss)；PV9000二步法试剂盒(中杉金桥)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Thermo)；SYBR® Select Master Mix试剂(Applied Biosystems)。显微镜(Olympus)；ND2000 超微量紫外分光光度计和ABI Fast 7500型实时荧光定量PCR仪(Thermo)。

3 主要方法

3.1心肌组织HE染色及形态观察 经4%中性甲醛液固定的心肌组织，石蜡包埋后行4 μm切片，HE染色后于光镜下观察心肌的结构变化，并采集图像。

3.2Western blot检测人心肌组织内melusin蛋白的表达 取出-80 ℃冰箱冻存的心肌组织(重量70～90 mg)匀浆，提取蛋白。用紫外分光光度计测量其浓度，以β-actin为内参照，行SDS-PAGE分离(12% SDS胶浓度)。PVDF膜转膜，5%脱脂牛奶封闭后孵育Ⅰ抗β-actin(1∶2 000)、melusin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)Ⅱ抗，经过底物显色后进行图像采集，采用ImageJ软件检测各泳道的灰度值并分析。

3.3IHC染色检测心肌组织内melusin蛋白的表达与分布 石蜡包埋的4 μm切片，脱蜡，水化，高压热修复抗原，以melusin抗体(1∶150)为Ⅰ抗，以PBS缓冲液为阴性对照，4 ℃孵育过夜。以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为Ⅱ抗，室温孵育40 min，经DAB显色2 min，苏木素复染30 s后封片。于镜下观察阳性表达细胞的位置、强度后在400倍镜下选取5个视野拍照，测量平均吸光度(阳性表达吸光度/测量总面积)以反应蛋白表达水平。

3.4real-time PCR测量心肌组织内melusin mRNA的表达量 采用TRIzol试剂提取心肌组织(70～90 mg)的总RNA。用紫外分光光度计对RNA进行定量，并进行逆转录。后加入荧光Mix试剂和引物在实时荧光定量PCR仪上测量Ct值，用2-ΔΔCt法计算mRNA表达量。PCR条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共40个循环。解离曲线条件为：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。所得的引物均是在NCBI网站Gene库中检索，并按照引物设计原则设计，最后由上海生物工程有限公司合成的。引物序列见表1。

4 统计学处理

所得数据行正态分布及方差齐性检验。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析；计数资料组间比较采用卡方检验。利用logistic回归对各个单变量与CHD的关系进行单因素分析，得出各个变量对CHD的优势比(odds ratio, OR)和95%可置信区间(confidence interval, CI)；并采用广义相加模型评估melusin的表达和CHD的相关性。数据均来自3次独立实验结果。使用SPSS 22.0统计学软件分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 Real-time PCR引物序列

结 果

1 光镜下观察并分组

按纳排标准收集冠状动脉及心肌组织，实验组各70例，对照组(A组)各20例。光镜下观察冠脉内膜，以脂质坏死核心占斑块面积的40%为标准[10]，进而根据斑块内是否存在继发病变将实验案例分为：B组，动脉粥样硬化斑块稳定组；C组，粥样硬化斑块不稳定组但无血栓形成、斑块破裂、斑块内出血等任一种继发病变者；D组，斑块不稳定组且伴有上述任一种继发病变者。分组依据见表2。

表2 分组的依据

In the case of secondary lesions, there is a single lesion or a combination of two or three secondary lesions.

2 病例基本情况

比较各组间基线资料，组间性别、身高、是否饮酒、是否有慢性呼吸系统疾病及慢性肝脏疾病等资料差异无统计学意义(P>0.05)；年龄、是否肥胖、心脏重量、左心室壁厚度、是否吸烟、是否有高血压及慢性肾脏疾病等资料差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

3 冠状动脉及心肌结构的病理变化

HE切片光镜下可见对照组血管壁薄，内膜平滑完整；B、C、D组见血管壁偏心性增厚，管腔不同程度狭窄，内膜下见纤维帽形成，于坏死核心底部及周边见泡沫细胞、淋巴细胞浸润及大量薄壁小血管增生；部分病例出现典型粥样坏死灶，坏死核心周边残留数量不等的泡沫细胞等炎症细胞，病灶表面纤维帽厚薄不一；病灶内还可见斑块内出血，血栓形成等继发病变，血管中膜弹性纤维断裂、平滑肌细胞受压萎缩变薄，外膜可见结缔组织增生及少量淋巴细胞浸润,见图1。

表3 案例的基线资料比较

BMI： body mass index.

Figure 1.Microscopic changes in coronary vascular structures (HE staining, ×40). A: control group; B: atherosclerosis but no sudden coronary death; C: sudden coronary death but coronary atherosclerotic lesions without secondary lesions; D： sudden coronary death and coronary atherosclerotic lesions associated with thrombosis.

图1 冠状动脉血管结构的显微改变(HE染色)

HE切片光镜下可见对照组心室肌细胞横纹结构清晰，核椭圆且染色均匀，心肌纤维形态规则; B组见部分心肌细胞体积增大，胞核增大、深染，形态不规则；部分心肌细胞出现萎缩改变，核浆比相对增大，心肌纤维间隙增宽，横纹模糊不清；C组可见心肌间质增宽，围绕间质小血管的心肌出现纤维化改变；D组见部分心肌伴不同程度的脂肪组织浸润，部分心肌于梗死灶的周边部出现凝固性坏死，呈网状分布，心肌细胞核消失，肌浆均质红染，嗜酸性染色增强，间质水肿，心肌纤维部分溶解消失，细胞间可见散在的单核细胞和淋巴细胞浸润等炎症反应,见图2。

Figure 2.Microscopic change in human myocardial tissue (HE staining, ×100).

图2 人心肌镜下病理变化(HE染色)

4 心肌组织内melusin蛋白的表达

Western blot结果显示与对照组相比，B组心肌组织中melusin表达显著升高(P<0.05)，C组中melusin水平较对照组比较明显降低，且D组melusin水平明显低于C组(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The result of Western blot for melusin. Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

图3 melusin的Western blot结果

5 心肌组织melusin的表达水平

IHC染色结果表明，对照组心肌细胞胞浆中有分布均匀的棕黄色着色，B组心肌细胞中棕黄色着色细胞颜色增深；C组中棕黄色染色的心肌细胞数量明显减少，着色变淡；而D组的心肌细胞胞浆中部分未见棕黄色颗粒的阳性表达，melusin表达显著减弱，阳性染色呈点片状分布，部分心肌可见大片缺染及淡染的情况，见图4。

用IPP 6.0软件分析检测melusin表达的平均吸光度，与对照组比较，B组阳性表达明显增高，C组和D组阳性表达显著降低(P<0.05)，见图4。

6 心肌组织内melusin mRNA的表达

real-time PCR结果显示，B组中melusin mRNA的水平与对照组比较有显著升高(P<0.05)；C组mRNA水平较对照组明显降低，D组melusin mRNA水平较C组减少(P<0.05)，见图5。

7 logistic回归和多元回归分析

各变量与CHD发病关系的回归分析结果显示，年龄、心脏重量、是否肥胖、是否吸烟、是否有高血压为CHD发生的危险因素；而melusin的表达是CHD发病的保护因素,见表4。在调整了各变量后，广义相加模型结果显示melusin的表达与CHD的发病密切相关，呈现显著的负相关性(OR=0.3； 95% CI: 0.2～0.4；P<0.01)。

Figure 4.Expression of melusin protein in human myocardial tissues (IHC staining,×400). Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

图4 人心肌组织melusin蛋白表达的IHC结果

Figure 5.The melusin mRNA expression in heart tissues. Mean±SD.*P<0.05 A groups;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

图5 各组melusin mRNA相对表达量

讨 论

研究表明，心源性猝死是法医病理猝死案件中最常见的类型[1]，其中冠心病性猝死位居第1位，约占心源性猝死的50%[11]。CHD是指因冠状血管病变导致心肌供血不足而引起的缺血性心脏病，缺血程度较轻者可没有明显不适或仅表现为心绞痛，程度较重者可因发生心肌梗死而危及生命，缺血程度严重者则会因心脏功能严重紊乱致短时间内死亡，即猝死。引起CHD发作的原因较多，其中以冠状动脉粥样硬化最为多见。由于冠脉内膜下脂质沉积、纤维组织增生及粥样坏死灶的形成等，使得病变部位血管壁出现不同程度增厚、弹性降低，管腔出现不同程度狭窄等改变，致使心肌供血不足从而引起CHD发作。

表4 logistic回归分析结果

Melusin is the correction factor.MA: mean absorbance.

Melusin蛋白是由基因ITGB1BP2(Xq12～q13) 编码的一种特异性肌肉组织蛋白，在骨骼肌和心肌中特异性的高表达。其作为整合素β1的功能性伴侣蛋白和支架蛋白，使细胞与细胞外基质的变化相互传导，让细胞能够更好的适应环境变化，从而维持细胞基本功能，提高生存适应性[7]。诸多研究证实，在正常生理条件下，心脏的发育和基础功能均不受melusin的影响[12]，但在出现主动脉瓣狭窄、冠状动脉粥样硬化、高血压等病理改变后，其表达增高可以维持心脏正常的节律性和收缩性，保持心脏形态，防止心室扩张并向心力衰竭过渡[13]。在小鼠冠状动脉粥样硬化模型中，melusin的存在不仅能减少炎细胞的浸润，还可以改善缺血远端的冠脉痉挛及心肌的状态，防止心脏发生破裂[6-7]，以上研究表明melusin作为一种保护性因子，参与了心血管系统疾病的发生，能够有效的减少心肌细胞凋亡，维持心脏的正常结构和生理功能，在冠状动脉疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥了积极的保护效应。

研究表明，melusin的高表达可以诱导心肌肥大，适度增加左心室壁厚度而不改变收缩功能，并且阻止进一步向扩张型心肌病和心力衰竭过渡，同时也可使远端缺血区域的存活心肌组织缺血情况有所改善[6]。本研究检测了不同程度冠状动脉粥样硬化病变下心肌组织中melusin的表达改变，发现在粥样硬化病变轻、心肌缺血程度较轻者的心肌中，melusin表达量增加，心肌细胞呈现出肥大改变。但在粥样硬化病变、心肌缺血严重的患者心肌中，我们检测到melusin表达量显著降低，甚至消失。同时我们将收集的各变量与CHD发病关系进行logistic回归分析，得到melusin蛋白在心肌组织中的表达和CHD发病呈显著负相关性，这提示melusin作为CHD发病的一种保护因素，可能通过调节某种信号转导通路，如PI3K/AKT及MAPK信号通路等[14-15]，减少了炎症细胞的浸润及纤维化，使心肌细胞凋亡减少，免受氧化应激的诱导，从而发挥保护心肌细胞的作用；而melusin含量的减少可能影响了上述信号通路对心肌组织的保护调节作用，进而加速病程的进展。但对其所影响的具体信号通路及机制还有待于进一步探讨。

此外，本研究还存在一定的局限性。首先，本研究资料统计属于回顾性研究，难以追溯缺失的基础资料，如血脂、血压、血糖等无法测量[16]，所以无法对这类因素与CHD发病之间的相关性作出评估；其次，本研究的样本量有限，可能存在选择偏倚。

综上所述，在不同程度冠状动脉粥样硬化病变下心肌组织中melusin的表达差异显著，且与冠心病的发生发展呈负相关，提示melusin可能是冠心病发生发展过程中心脏的保护因素。