超高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠肿瘤组织中阿霉素药物浓度

(1.国家纳米科学中心，北京100190；2.岛津企业管理(中国)有限公司，北京 100020)

阿霉素属于蒽环类细胞毒性抗生素，抗癌谱广且治疗指数高，目前广泛用于白血病及乳腺癌、结肠癌、肝癌等实体肿瘤的治疗，是临床常用的恶性肿瘤化疗药物之一，结构见图1。但是，由于阿霉素在体内的代谢效果不佳，因而会产生一系列不良反应，在生物体内会产生严重的心脏毒性和骨髓抑制作用[1-3]，需要体内药物浓度测定及病理分析等数据进行客观评价。近年来，人们在研究阿霉素血浆药物浓度的同时，其生物体内药物浓度定量分析检测也受到重视，两者更好的结合能阐明阿霉素在体内代谢过程，有效地评价生物利用度[4-6]。

阿霉素在生物体内测定方法国内报道主要有HPLC-UV、荧光光度法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等方法[7-10]，而高效液相色谱-串联质谱法报道较少。但这些方法均存在选择性差、灵敏度低、分析时间长等缺点，技术要求复杂，不利于大量样品的测定。本实验采用正离子模式多反应监测(MRM)方式，建立了一种新的操作简便、快速、灵敏、特异的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定阿霉素在达肿瘤部位的药物浓度的方法，并对其进行专属性、线性范围、检测限、准确度、精密度、回收率和稳定性的考察，旨为进一步开发利用阿霉素在生物体内的分布奠定基础。

图1 阿霉素(C27H29NO11)的化学结构式

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LC-MS/MS 8050液质联用仪(日本岛津公司)；电喷雾离子化电离源(ESI)、LabSolutions软件(Ver.5.91)；BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；HH-1型旋涡混匀器(北京赛欧华创科技有限公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)； DY89-II型玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q ADVANTAGEA10纯水仪(美国Merck Millipore 公司)。

1.2 试剂材料与实验动物

MCF-7乳腺癌细胞系(中国协和医科大学基础医学研究所)；DMEM高糖培养基，胎牛血清(Life Technology公司)；阿霉素标准品(广州市左克生物科技发展有限公司)；柔红霉素(北京沃凯生物科技有限公司)；甲醇(美国Fisher公司产品)；甲酸(美国Sigma公司)；固相萃取柱(日本岛津公司)；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

25只雌性BALB/c-nu小鼠，体重(20±2)g，动物合格证号：SCXK(京)2016-0006由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件

Shim-Pack GISS-HP C18色谱柱(100mm×2.1mm×3μm)；流动相：A相为含0.1%甲酸的超纯水，B相为甲醇；采用梯度洗脱程序：0～0.5min，10%～80%B；0.5～2.5min，80%～100%B；2.5～3min，100%B；3.1～7min，100%～80%B；柱温40℃；流速0.2mL/min；进样体积1μL。

1.3.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI源)；扫描方式为多反应监测(MRM)，正离子电离模式；离子喷雾电压：4.5kV；雾化气(氮气)流速：3.0 L/min；加热气(空气)流速10L/min; 干燥气(氮气)流速：10L/min；脱溶剂管温度250℃；加热模块温度：400℃；离子源温度：300℃；用于定量的离子分别为阿霉素m/z544.2→397.2，柔红霉素(内标)m/z528→321。质量扫描范围m/z100～1000。样品测试前，使用调谐液校正质量轴。

1.4 实验方法

1.4.1标准溶液和内标溶液的配制

精密称取1.00mg阿霉素标准品，置于1mL容量瓶中，用超纯水溶解稀释并定容，配制成浓度为1.00 g/L的母液；然后用50%甲醇水再逐级稀释成浓度分别为100、200、400、1000、5000、10000μg/L的工作液，置于4℃冰箱。

精密称取1.00mg柔红霉素标准品，置于1mL容量瓶中，用超纯水溶解稀释并定容，配制成浓度为1.00g/L的母液；取上述储备液用50%甲醇水稀释成浓度为15μg/L的内标溶液，置于4℃冰箱。

1.4.2细胞实验：

DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清，细胞接种于100 mm2培养皿中，置于5% CO2培养箱，37℃培养，当细胞生长至融合度80%左右时传代备用。

1.4.3动物实验

选择处于对数生长期的细胞，细胞达80～90%左右密度为宜，用胰酶消化细胞后用PBS清洗两次，再用PBS吹打细胞沉淀至合适的浓度，细胞计数器进行计数。皮下瘤接种细胞量为1～5×106个细胞/只，接种体积为100μL，因此细胞悬液的浓度为1～5×107个细胞/mL，细胞与Matrigel基质胶1∶1混匀后，用胰岛素注射器注入小鼠皮下。BALB/c-nu小鼠在标准环境下(湿度(50±10)%，温度25±2℃，12h昼夜循环)进食进水，实验前禁食12h。BALB/c-nu小鼠荷瘤后，待肿瘤体积长到约150mm3，按照0.2mg/kg剂量尾静脉注射，开始给药。

1.4.4样品前处理

称取2.5g匀浆后的样品，加入80%乙腈10mL，旋涡震荡，置于预置好的4℃高速冷冻离心机内4000r/min高速离心5min，取上清液待净化。加入1mL甲醇，涡旋5min，超声溶解15min。提前用甲醇水(1∶1)对固相萃取柱进行活化平衡，将待净化液上样至固相萃取柱进行过柱，依次用水、50%甲醇溶液各1mL淋洗，抽干。用甲醇洗脱，收集洗脱液用氮气吹干，1mL初始流动相定容，经0.45μm滤膜过滤，上机待测。

1.4.5样品采集与制备

将小鼠尾静脉注射0.2mg/kg阿霉素，在2h后处死，取肿瘤组织，以蒸馏水洗净，称其质量；按质量-体积比1∶5向各组织中加入生理盐水，冰上匀浆后，按照“1.4.4”项对样品进行前处理后转移至1.5mL Eppendorf管内，向每个样品中加入10μL 15μg/L柔红霉素内标溶液，用流动相定容至1mL；经0.45μm滤膜过滤，置于4℃冰箱中，上机待测。

2 实验结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

取100μL空白小鼠的组织(肿瘤)匀浆清液于1.5mL Eppendorf管中。向每个样品中加入不同质量的阿霉素配制成浓度分别为100、200、400、1000、5000、10000μg/L的系列标准溶液；加入10μL 15μg/L柔红霉素作为内标，用移液枪混匀，再加入300μL甲醇，涡旋5min，以13000r/min离心10min，取上清液；经0.45μm滤膜过滤，进样检测。测得的阿霉素峰面积与内标柔红霉素峰面积的比值Y对药物浓度X进行线性回归，绘制标准曲线。

2.2 专属性考察

在电喷雾正离子模式下，总离子流图见图2。通过比较供试空白组织色谱图、向空白组织中加入待测物和内标物后得到的总离子流图(TIC)、提取离子流图(EIC)和给药后不同时间测得的色谱图，待测药物阿霉素和内标柔红霉素的保留时间分别为1.49min和1.62min。结果表明，空白组织中所含内源性物质不干扰被测物及内标物的测定，被测物峰形良好。

图2 肿瘤组织MRM质谱图A.空白组织；B.空白组织加入阿霉素及内标柔红霉素；C.小鼠尾静脉注射阿霉素2h后肿瘤组织样品；1.阿霉素；2.内标柔红霉素

2.3 线性范围及检测限

按照“2.1”项下操作，进样1μL，记录色谱图；以待测药物浓度X(μg/L)为横坐标，待测药物与内标的峰面积比Y为纵坐标，用加权(w=1/X2)最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程为：Y=0.00454786X-0.270637(r=0.9999580)。结果表明，阿霉素在肿瘤组织内药物浓度在100～10000μg/L内，质谱响应的线性关系良好，以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)，得阿霉素的LOD为0.56μg/L。

2.4 日内与日间精密度与方法回收率

取空白小鼠肿瘤组织提取液100μL，按 “1.4.1”项下分别配制阿霉素匀浆液高、中、低3个浓度(100、400、10000μg/L)的质量控制(QC)样品，每个浓度进行5个样本分析，连续测定3d，为保持实验条件一致，标准曲线的测定与上述样品测定同时进行。以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，将QC样品的结果进行计算并分析，精密度和回收率结果见表1。结果表明：阿霉素在肿瘤组织提取液中的日内和日间精密度RSD均小于15%，方法回收率良好[11]，均可满足2015版药典四部通则中对于生物样品定量分析方法验证指导原则中相关规定。

表1 测定方法的精密度、准确度和回收率

2.5 稳定性考察

按“1.4.1”项下分别配制阿霉素肿瘤组织提取液高、中、低3个浓度的QC样品，每个浓度进行3个样本分析。分别将样品在室温(约20℃)下放置6h、4℃下冷藏8h、-20℃冻融循环3次，按“1.4.4”、“1.4.5”项下操作处理后进样测定，考察小鼠的肿瘤组织提取液中阿霉素在室温、冷藏、反复冻融条件下的稳定性。以每一浓度3个样本分析，3种情况下稳定性样品与新配制样品的峰面积比值均在80%～120%之间，说明阿霉素在本研究考察的储存条件下较稳定[11]。

表2 阿霉素在肿瘤组织基质中的稳定性(X±SD，n=3)

注：表中数据=(稳定性样品峰面积/理论样品峰面积)×100%

3 结论

本研究建立了LC-MS/MS在小鼠肿瘤组织测定阿霉素药物浓度的方法，该方法简便快速、专属性强、灵敏度高、分析效率好，可弥补阿霉素类物质在紫外吸收差、检测限值高的缺陷。另外样品前处理是药物分析的关键部分，由于生物样品的介质组成比较复杂，如前处理不好，严重影响检测结果，而本方法中采用先甲醇直接沉淀蛋白的方法对生物样品进行预处理，同时结合固相萃取柱的方式，重现性好，回收率高，操作简便，选择沉淀蛋白的溶剂与所选用的流动相一致，不会有其他成分干扰，成本较低，为检测创造了良好的条件。液相色谱仪结合色谱柱的使用，提高了色谱的分离效率，加快了分析速度。质谱检测采用电喷雾正离子电离模式，在尾静脉注射阿霉素小鼠的肿瘤部位能检出阿霉素，阿霉素定量范围在100～10000μg/L之间。该方法适用于生物样品中阿霉素类成分的高通量分析。