钛种植体表面不同抗菌处理方式对细菌粘附能力的影响研究*

2020-04-01鲍合刚王金兰

中国医学装备 2020年3期

鲍合刚李俊钟飞王金兰何坤

口腔种植材料—钛金属，具有良好的机械性能和抗腐蚀作用而广泛用于口腔种植相关领域。钛种植体表面需要具备促进骨整合、抑制菌斑形成等功能，而细菌粘附、生物膜的形成是引起种植体周围炎，并最终引起种植失败的主要原因[1]。为了降低种植体周围炎发生率，除了保持良好的口腔卫生外，亦可通过改良种植体表面特性，减少细菌粘附。种植体表面粗糙度对细菌粘附力影响会随着种植体表面生物膜的成熟而消失，但是临床上对于种植体表面粗糙度对细菌粘附的影响机制尚未明确[2-4]。因此，临床上多数学者开始致力于种植体表面改性研究。随着材料微处理技术的兴起，使得阳极氧化纯钛表面形成TiO2纳米管，具有良好的生物活性及成骨性能[5]。但是，临床上对于抗菌性能的影响研究较少。为此，本研究以TiO2纳米管作为研究对象，探讨其表面加载抗菌药物与激光照射表面抗菌处理的两种抗菌方法对钛种植体中间普氏菌粘附能力的影响。

1 资料与方法

1.1 研究资料

选择规格为TA2的纯钛片，将TA2纯钛片进行阳极氧化获得36片粘附细菌效果最好的TiO2纳米管，按照不同抗菌处理方法将其随机分为对照组和观察组，每组18片。对照组种植体表面采用载入盐酸米诺环素药物对TiO2纳米管进行抗菌处理，观察组种植体表面采用激光照射进行抗菌处理，测量不同时间节点细菌粘附数量，并测试其钛表面性能。

1.2 仪器与试剂

采用商业纯钛(西北有色金属研究院)；中间普氏菌(上海市口腔医学研究所)；LS-450型辉光离子渗金属真空炉(北京仪器厂)；MIP-8-800型多弧离子镀膜机(中国科学院力学研究所)；S-4800型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；Axiovert 25 CA光学图像分析仪(德国Zeiss公司)；血琼脂平板(武汉博士德生物有限公司)。

1.3 钛种植体表面处理及细菌粘附测试

1.3.1 钛种植体表面处理

(1)钛种植体表面经碳化硅砂纸顺序抛光至1500目，然后通过0.3%氢氟酸和1 mol/L磷酸的氧化电解液，阳极为钛片，阴极为石墨电极，在直流电源室温下氧化处理1 h，再用无水乙醇和去离子水超声清洗30 min，消毒干燥，获得所需TiO2纳米管。

(2)将TA2纯钛片切割为10 mm×10 mm×0.5 mm的薄片(36片)待用。表面经碳化硅砂纸顺序抛光至1500目，用丙酮、无水乙醇及去离子水依次超声清洗15 min，自然干燥。根据钛片表面是否阳极氧化及氧化时所用电压为10 V和20 V，分别进行表面经砂纸顺序抛光后喷砂酸蚀(sandblasted acid etched，SLA)处理、电压为10 V纳米管阳极氧化处理和电压为20 V纳米管阳极氧化处理。获取不同管径大小和不同表面形貌的TiO2纳米管，通过纳米管表面细菌粘附效果分析，获得粘附效果最好的纳米管组，并为其组纳米管表面进行加载抗菌药物以及激光照射做准备。

(3)阳极氧化生成TiO2纳米管。选用0.3%氢氟酸和1 mol/L磷酸为氧化电解液，阳极为钛片，阴极为石墨电极，直流电源室温下氧化处理1 h，而后热处理升温至500 ℃再冷却至室温。试件皆用无水乙醇和去离子水超声清洗30 min，消毒干燥。①在电场的作用下，钛表面形成致密的氧化钛阻挡层；②F-与阻挡层发生化学作用形成可溶性的TiF-，形成不规则凹痕；③凹痕逐渐发展成小孔；④小孔密度增加，在表面形成有序结构；⑤阻挡层推进的速度与氧化层的溶解速度相等时，孔的长度停止增加。电化学阳极氧化设备见图1。

图1 电化学阳极氧化设备示意图

1.3.2 细菌粘附测试

(1)试件表面形貌观察及细菌粘附分析。在每组内取3个试件，分别进行扫描电镜观察、原子力显微镜观察和X射线衍射分析。对中间普氏菌的粘附效果分析，将中间普氏菌浸于脑心浸液肉汤(brain heart infusion，BHI)溶液中，浸液琼脂平板37 ℃培养24 h，配成菌液待用。每组选取试件各10个放入培养板内，吸取菌液接种于试件表面，按流程培养，分别在培养后24 h、72 h和120 h进行菌落计数。试件细菌种植后，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗，脱水，干燥。试件喷金后扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)观察细菌形态。

(2)抑菌效果。选取对中间普氏菌粘附效果最好的一组，继续制作试件36个并接种中间普氏菌分为观察组和对照组：对照组给予载入抗菌药物盐酸米诺环素，观察组采用激光照射处理，选择激光波长为500 nm的低强度照射5 min，对比两组处理后钛表面的抗中间普氏菌的性能，每组试件放入培养板内，吸取菌液接种于试件表面，按流程培养，分别于24 h、72 h和120 h进行菌落计数。各组选取1个试件抗菌接触实验终止后，PBS漂洗，加入荧光染色剂，观察荧光强度并计算死菌/活菌比值。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件对数据进行统计分析，数据采用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，经Levene's方差齐性检验，方差齐性者采用Bonferroni进行两两分析比较；若方差不齐者，则采用Games-Howell法进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TiO2纳米管扫描电子显微镜结果

对照组处理后仅使原有表面粗糙度值略微增加，但均＜0.2 μm；扫描电镜结果中对照组处理后材料表面原始划痕消失；观察组处理后表面为一层均匀致密层，且为多孔隙结构。TiO2纳米管扫描电子显微镜图像见图2。

图2 TiO2纳米管扫描电子显微镜图像(×1000)

2.2 两组不同时间点细菌集落平均数比较

观察组与对照组纳米管钛表面吸附菌落总数，对照组随着时间的延长细菌集落平均数呈上升趋势。不同时间点细菌集落平均数比较分析，观察组激光照射后与对照组抗菌钛表面的抗中间普氏菌的性能处理24 h、72 h细菌数比较，差异无统计学意义(t=1.295，t=1.058；P＞0.05)；观察组通过激光照射后纳米管钛表面的抗中间普氏菌120 h细菌平均数少于对照组，其差异有统计学意义(t=9.683，P＜0.05)，见表1。

表1 两组不同时间点细菌集落平均数比较(106CFU，)

2.3 两组细菌荧光染色分析

细菌荧光染色结果表明：观察组处理后细菌荧光染色数量较少，而对照组处理后细菌荧光染色数量相对较多。细菌荧光染色分析见图3。

图3 两组细菌荧光染色分析图像(×1000)

2.4 两组表面处理后扫描电镜下细菌数比较

对照组表面处理后扫描电镜下细菌数量相对较多，且细菌相对集中；观察组表面处理后细菌数量相对较少，细菌分布相对分散。两组表面处理后扫描电镜下细菌数见图4。

图4 两组表面处理后扫描电镜下细菌数比较(×2500)

3 讨论

近年来，随着口腔种植技术的不断发展，纯钛成为口腔种植植入材料，由于良好的机械性能及生物相容性良好而在临床上广泛使用。但是，由于纯钛自身良好的金属特性，导致其龈缘薄弱部位容易透出金属、金属离子析出，影响牙龈着色美观[6-7]。本研究中，阳极氧化处理后使原有表面粗糙度值略微增加，但是均＜0.2 μm；扫描电镜结果表明，对照组处理后材料表面原始划痕消失；观察组表面处理后为一层均匀、致密层，且为多孔隙结构，钛表面形成复合物，表明纯钛在口腔种植中效果理想，结构致密，符合口腔种植需要。国内外学者[1，4，8]研究表明，菌斑聚集是种植体周围炎发病始动因素，而细菌的粘附、定植被视为感染的关键作用，且细菌的定植具有一定的顺序，链球菌、放线菌是早期常见的定植菌，能为细菌后期定植提供表面粘附作用。普氏菌是口腔链球菌的主要菌种，对牙面具有良好的亲和力，但是细菌的粘附机制尚未明确，多与材料、微生物及宿主等因素有关[9-10]。

本研究中，观察组与对照组随着时间的延长细菌集落平均数呈上升趋势，不同时间点细菌集落平均数比较具有统计学意义；观察组与对照组材料表面处理后24 h、72 h细菌数比较无统计学意义；观察组表面处理后120 h细菌平均数少于对照组；细菌荧光染色结果中，观察组处理后细菌荧光染色数量较少，而对照组处理后细菌荧光染色下数量相对较多，表明TiO2纳米管表面定植细菌随着时间的延长定植数量增多，而观察组给予表面处理后表面定植的细菌数量较少，激光照射处理后抗菌粘附效果较好。激光照射技术是一种新型的干预方法，通过对工件表面进行设计与激光表面处理，从而改变表面性能[11]。同时，该方法利用激光光束快速、局部加热条件，能在短时间内改变材料表面性质，结合临床所需改变激光参数，可以解决不同表面处理工艺问题[6，12]。临床上，激光照射处理根据表面处理的目的不同分为激光重熔、激光涂覆及去除处理等，均能实现表面性能改善，能选择性的处理钛种植体表面，使得材料表面获得足够的韧性与强度，获得耐磨、抗氧化及耐腐蚀等性能[3，6，13]。本研究中，将处理后的标本放置在荧光显微镜下进行观察，利用图像分析仪测定样本表面细菌粘附比，结果表明，对照组表面处理后细菌数量相对较多，且细菌相对集中，但观察组表面处理后，细菌数量相对较少，细菌分布相对分散，表明TiO2纳米管经过激光照射处理后细菌粘附性降低，能增强材料的抗菌粘附性能。既往研究中，激光处理后能在TiO2纳米管表面形成一层均匀的、致密的改性层，能抑制金属钛的活跃性，形成性质较为稳定的氧化膜，从而能发挥细菌抑制作用。但是，临床上由于TiO2纳米管的用途、使用目的存在明显的差异性，在表面处理时应结合本实验室的情况选择合适的方法，尽可能减少钛种植体周围菌斑附着，降低局部组织炎症，提高临床种植成功率，促进患者早期恢复[12-15]。