DNK-A400全自动微生物联合检测仪检测真菌1-3-β-D葡聚糖和曲霉半乳甘露聚糖的性能评价

张雨虹，王云英

(重庆医科大学附属第二医院，重庆)

0 引言

临床上侵袭性真菌病（Invasive fungal disease，IFD）感染率和致死率不断增高，真菌感染的早期诊断和治疗可显著降低患者死亡率[1-2]。IFD的传统检测方法主要为真菌镜检、各种培养基培养鉴定、组织病理学诊断，但存在耗时长、成本高昂、工序复杂等缺点[3]。1-3-β-D 葡聚糖（1-3-β-DGlucan, G）实验及曲霉半乳甘露聚糖（Galactomannan, GM）实验可以对IFD进行快速诊断，已成为IFD早期检测的重要手段之一，被列入真菌诊断和治疗指南[4]。由此，重庆医科大学附属第二医院引进了基于G实验与GM实验的仪器设备，对患者进行真菌快速诊断。研究使用新购进的丹娜生物DNK-A400全自动微生物联合检测仪分别进行G实验和GM实验，验证仪器精密度、正确度、线性范围及抗干扰等指标，进行综合性能评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料

于川大华西医院收集G实验阳性、阴性血清样本各10例，重医附一院GM实验阳性、阴性血清样本各10例，一次性无菌无热原真空采血管按标准方法采取静脉血4mL，3000 r/min离心10min，收集血清。精密度验证采用多个不同浓度的血清相互混匀，设置为高、低两个浓度；正确度实验样本为以上两所医院提供的带有原始结果数据的留存样本；线性范围验证使用高、低浓度标准品按一定比例配成为指南设计最高/最低检测范围内不同浓度梯度的六个样本；干扰评价采用含有高水平胆红素的黄疸血清分别与阳性和阴性标本按照 1：9、3：7、1：1三种不同比例混合，以设置为高、中、低程度的干扰[5]。

1.2 仪器与材料

仪器：丹娜生物DNK-A400全自动微生物联合检测仪，以及金属浴孵育器、漩涡混合器、高速离心机（10000r/min）。

材料：厂商提供的G实验、GM实验所用试剂盒材料，内含反应主剂、处理液、标准品、质控品、溶解液及主剂复溶液。

1.3 检测方法

参照全国临床检验操作规程，严格按照仪器的操作规程和试剂说明书操作，在室内质量控制结果允许范围内对样本进行检测。由DNK-A400全自动微生物联合检测仪自动化完成精密度、正确度、线性范围及干扰因素实验所需数据的测量。通过参考G实验与GM实验的相关指南及各类报道发现：目前该两种实验仪器的性能评价尚无统一的标准规则[6-8]。因此，对于实验数据的判定方法参照《GBT 26124-2011临床化学体外诊断试剂（盒）》国家标准与《YYT 1183-2010 酶联免疫吸附法试剂（盒）》行业标准进行。方法如下：

1.3.1 精密度验证

将高、低两个浓度的样本每天连续检测5次，持续检测3天，用得出的15组数据，计算精密度（cv%）；若CV值不超过10%，则精密度验证通过[9]。

1.3.2 正确度验证

G实验以川大华西医院丹娜检测结果作为对照，GM实验以重医附一院伯乐检测结果作为对照，在DNK-A400全自动微生物联合检测仪上对样本进行检测，每个样本测试1次，用卡方检验评价两者结果的一致性[10]。

1.3.3 线性范围

在试剂说明书的线性范围两端选取高、低浓度的两份标准品，为高值（H）样本和低值（L）样本，按 5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L配置成6个浓度梯度的样本，每个样本重复检测2次，计算平均值。将理论值和实测值进行线性回归，计算线性相关系数r2；若G实验r2＞0.99，GM实验r2＞0.98，则表明线性关系良好，可接受其分析测量范围[11]。

1.3.4 干扰实验

采用添加外源性胆红素的方式进行抗干扰实验，将高水平胆红素的黄疸血清分别与阳性和阴性样本按照1：9、3：7、1：1三种不同的比例混合，检测其浓度，计算检测浓度与理论浓度间的偏倚（%），作为干扰率，以干扰率≤10%作为是否存在明显干扰为判断标准[12]。

1.4 统计学方法

所有数据使用Microsoft office Excel和SPSS 17.0软件进行处理。

2 结果

2.1 精密度验证

DNK-A400全自动微生物联合检测仪进行G、GM实验，G实验高、低两个浓度样本精密度分别为6.78%、7.85%， GM实验高、低两个浓度样本精密度分别为7.53%、9.83%，均低于试剂盒的精密度指标，符合临床要求（见表1、表2）。

表1 G实验精密度评估结果（n=15）

表2 GM实验精密度评估结果（n=15）

2.2 正确度验证

检测G实验阳性、阴性样本各10例，DNK-A400全自动微生物联合检测仪检测的定性结果与川大华西医院阳性值符合率90%，阴性值符合率为90%；检测GM实验阳性、阴性样本各10例，其定性结果与重医附一院伯乐的阳性值符合率90%（P＞0.05），阴性值符合率为90%（P＞0.05），均符合厂商指标（见表3、表4）。

表3 G实验正确度评估结果（n=20）

表4 GM实验正确度评估结果（n=20）

2.3 线性范围验证

根据G实验和GM实验的样本结果分别制定了回归曲线（见图1、图2），可以看出，G实验线性相关系数r2＞0.99，GM实验线性相关系数r2＞0.98，数据呈线性关系，线性良好；验证的G实验和GM实验分析测量范围分别为 38.8～606.680pg /mL、0.351～4.292ug/L，与厂商指标37.5-600pg/mL、0.25-5ug /L相近，可以接受厂商的分析测量范围（见表5）。

图1 G实验浓度与OD值线性关系

图2 GM试验浓度与OD值线性关系

表5 G实验及GM实验线性范围评估结果

表6 G实验干扰因素验证结果（n=8）

表7 GM实验干扰因素验证结果（n=8）

2.4 干扰因素验证

将含高水平胆红素的黄疸血清按一定比例分别与G实验、GM实验阳性和阴性样本混合成高、中、低程度干扰样本，检测后计算其干扰率，以干扰率≤10%作为评价标准，进行性能验证。结果显示G实验高浓度干扰范围为-45.58%-41.25%，中浓度干扰范围为-31.36%-39.68%，低浓度干扰范围为-9.42%-9.63%，GM实验高浓度干扰范围为-11.03%-11.46%，中浓度干扰范围为-10.44%-9.70%，低浓度干扰范围为-9.22%-8.54%，表明G实验在低浓度胆红素干扰下影响较小，GM实验在高、中、低浓度胆红素干扰下影响轻微，干扰率基本低于10%（表6、表7）。

3 总结与讨论

DNK-A400全自动微生物联合检测仪是丹娜生物公司提供的一款自动化侵袭性真菌检测设备，具有操作简便、重复性和稳定性好、适用性强和抗干扰能力强的特点。然而，不同实验室温度、湿度、水质及人员操作习惯等检测条件有很大差异。因此，按照IS015189“医学实验室质量和能力的专用要求”的规定，设备应在安装及常规使用中显示出能够达到规定的性能标准，并且符合相关检验所要求的规格。

精密度是检测中最基本的性能指标，本研究验证了丹娜生物DNK-A400全自动微生物联合检测仪在G实验、GM实验精密度分别为6.78%～7.85%、7.53%～9.83%，精密度良好，表明该仪器在本实验室检测环境中系统重复性符合要求，符合临床检验的质量要求。

正确度为若干次测量结果平均数与定值的质量控制品或校准品进行对比，所得出的准确程度。因目前G、GM检测无公认的参考物质，也无合适的室间质评材料。因此采用将G实验所测结果与川大华西医院检测结果进行对比，GM实验与重医附一院伯乐检测结果进行对比，通过阴阳性符合率来评估仪器正确度。本次检测中阴性、阳性符合率均达到90%，符合该仪器检测系统正确度性能要求。

线性范围评价表明，G实验线性相关系数r2为0.9999，GM实验线性相关系数r2为0.9854，符合线性关系。因此可以接受厂商提供的37.5-600pg /mL、0.25-5ug /L分别作为G实验、GM实验分析测量范围。

因本所医院感染科病人极多，黄疸病人的血清中胆红素无法祛除，因此设计胆红素干扰实验，以验证其性能。干扰结果表明，G实验在低浓度胆红素干扰下影响较小，GM实验在高、中、低浓度胆红素干扰下影响轻微。我们猜测是由于G实验是通过动态显色法检测血清中的真菌1-3-β-D葡聚糖，胆红素血清中色素无法祛除，对其有一定干扰；GM实验是通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中的曲霉半乳甘露聚糖，胆红素血清对其影响轻微。

丹娜生物DNK-A400全自动微生物联合检测仪进行G实验、GM实验检测侵袭性真菌的方法学性能良好，性能评价所有项目均能够基本达到预期，能为临床快速提供准确、可靠的检验结果，能够满足急诊检验工作的需要，对侵袭性真菌的早期诊断和临床用药具有重要意义。