大头金蝇线粒体ND3基因的遗传多样性分析及其法医学应用

贾彬，冯添翼，刘新良，宋智敏，娄志国，刘钦来

(山东第一医科大学（山东省医学科学院），山东 泰安)

0 引言

大头金蝇起源于东南亚，世界各地均有分布，属双翅目丽蝇科金蝇属，我国多数省份均有分布，是常见的医学媒介昆虫，为刑事案件中死亡时间和死亡地点的推论提供刑侦证据，拥有较强的法医学研究价值[1]。目前的主要研究在于蝇种鉴定及其幼虫生长发育时间推断死亡时间，但采用形态学方法种类鉴定常会受到各种限制，分子生物学DNA技术成为基因鉴定和种群研究的新兴热点，特别对于遗传多态性结合地理隔离推断死亡地点的研究目前还很少[2-3]。

线粒体具有结构简单，基因构成稳定，易于测序，母系遗传的各项特点，且缺少核DNA的修复保护能力而易受地理因素影响突变（突变率为核DNA的5-10倍），常常被用作遗传多样性分析和基因鉴定的研究对象，大头金蝇线粒体ND3基因是线粒体NADH氧化还原酶一个亚基的编码基因，具有进化速率相对较快，序列变异率较高的特点，常被应用于类群系统发育研究中，本文将各地区大头金蝇线粒体ND3基因进行比对并结合地域信息加以分析，研究与地域的相关性，完善中国大头金蝇线粒体研究并对其在死亡地点的研究提供新的思路[4-6]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 捕集方式

通过悬挂式捕蝇笼，在12个采集地点的火车站、室外草地、厕所等位置用腐败的鱼类为诱饵捕捉食腐昆虫，初步挑选苍蝇个体后用75%酒精浸泡，-80℃保存，实验时经过形态学鉴别选择出大头金蝇。

1.1.2 实验仪器

美国ABI公司的PCR扩增仪（型号：A24811），BIO-RAD公司的核酸电泳系统和凝胶电泳系统（型号：Tanon-3500R）。

1.1.3 实验试剂

动物DNA快速提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、高保真PCR反应试剂盒（南京维诺赞生物科技有限公司）。

表1 各地区大头金蝇采集信息

1.2 方法

1.2.1 运用CTAB法提取mtDNA样品[7]。

1.2.2 PCR扩增和测序

应用软件Primer5，模板为大头金蝇线粒体（GenBank：NC019633.1），设计上下游引物（上游 5’-3’：ACTCAAACCACCCA TTCCATT 下游 5’-3’：CGCTTCATATTCAAGGTAGATTG），之后用PCR反应试剂盒扩增，扩增后序列送至上海生工生物科技有限公司进行测序。（条件：94℃预变性 3min；94℃变性 15s；退火15s，退火温度49.3℃；72℃延伸65s；彻底延伸10min；循环数35-40个。）

表2 大头金蝇各种群ND3基因突变及突变位点

2 数据分析

2.1 不同地区大头金蝇的遗传多样性分析

大头金蝇线粒体ND3基因全长354bp，起止点为5558-5911（GenBank：NC019633.1）,此次实验的设计引物起止点为4708～5989，测序长度为1281bp，通过剪切后的实际长度为354bp。12个地区的样本测序结果共发现保守位点344个，变异位点10个：其中自裔位点5个（位点位置：101 132 149 310 342），简约信息位点5个（位点位置78 225 247 309 315），样本总体平均核苷酸差异为1.34689，核苷酸多样性（Pi）为0.380%，12个地区样本的核苷酸多样性介于：0.00226～0.00508，其中TY地区和YC地区的核苷酸多样性最高，12个地区样本共产生12个单倍型。

2.2 不同地区大头金蝇间的遗传分化研究

运用WinArl35软件对12个大头金蝇种群进行群遗传分化研究，发现12个种群群体内总体遗传分化系数Fst =0.10299，结果表示总变异数的89.70%为群体间变异，10.30%为群体内变异，表明群体间存在较大遗传分化。12个种群间发现5组具备统计学意义的Fst数据，范围是0.3500～0.6000。SL-BZ两地群体（Fst值为0.6000）遗传分化程度最大，KM-EEDS两地群体（Fst值为0.3500）遗传分化程度最小。

2.3 多重序列比对统计地域性SNP位点和单倍型

2.3.1 SNP位点统计数据

用Genbank中大头金蝇线粒体DI212序列（GenBank：NC019633.1）为模板，运用MEGA6.0软件，将60条中国大头金蝇ND3序列与之比对（表2），由表可知12个地区的大头金蝇群体共出现5个共享SNP位点，5个私有SNP位点，其中225号位点共享频率最高，私有SNP位点均为单只出现。

2.3.2 单倍型统计数据

从DNAsp 5.0软件分析单倍型分布情况中可以发现（表3），KM,TY,YC等7个地区具有私有单倍型，H1,H2,H3,H5,H6单倍型为共享单倍型，其中H2单倍型出现频率最高，在9个地区中均有出现。

表3 大头金蝇各种群单倍型分布情况

2.4 地域特征的SNP位点的验证

本文通过地域间种群遗传多样性这一理论依据找到了一些具有地域特征的SNP位点，但这些SNP位点是否具有地域性和稳定性，能否用作法医学死亡地点推测的理论支撑仍需验证，故本文于第二年，采用随机抽样的方法在上年的12个地区中抽取了4个地区,中国南方两个地区（昆明和广西），中国北方两个地区（鄂尔多斯和枣庄），重新捕捉苍蝇进行验证。每一个地区验证4只苍蝇，实验结果如图1。在鄂尔多斯地区验证实验中，EEDS7，EEDS9均在315位点（C-T）产生突变，证明中国北方苍蝇在此位点的突变稳定性和特异性。在桂林地区和昆明地区验证实验中，GL6在309位点（A-G）产生突变，说明南方苍蝇在309位点存在突变的稳定性和特异性。若309（A-G）,310（C-T）同时存在突变，也可进一步认为是KM地区存在的突变，但是由于本实验中实验数量有限，仍需要进一步探寻。

图中绿色部分代表前期实验数据、蓝色部分代表验证实验数据、黄色部分代表详细突变情况。

3 讨论

线粒体DNA具备细胞内最大的拷贝量，拥有比核DNA更高的突变率[8]，ND3为线粒体上的一个基因，我们期望ND3基因可以延续线粒体高突变率这一特点。通过对ND3基因的数据分析发现，其拥有较明显的AT偏向（77.87%），其特性与包含双翅目在内的昆虫线粒体DNA相符（mean A=30% T=43% C=12%G=15%[9-10]）。

群体内遗传分化贡献率为10.30%，群体间遗传分化贡献率为89.70%，表明群体间变异是变异的主要来源，群体间具有显著差异也就是说地域间具有显著差异性，这种遗传分化的差异性反应的是地域之间的地理环境的差异性。进一步说明地域群体在遗传结构上存在的差异能够反应地理环境之间的差异。

生物种群产生一定方向的歧化选择与各个地区环境气候间的差异性有关，这种选择导致遗传性的突变，具有地域性分布的地理隔离便由此生成[11]。本实验通过研究中国12个经纬度和环境气候相差较大地区的大头金蝇种群，发现其中有多个地区具备地域性特征的SNP位点和私有单倍型，“例如KM地区的310号突变位点，H4单倍型；TY地区的101号突变位点，H7单倍型；YC地区的132号突变位点，H8单倍型；BZ地区149号突变位点，H11单倍型；SL地区342号突变位点，H9单倍型等。”本实验拟利用这些具备地域性特征的SNP 位点和私有单倍型来进行地域推测，例如根据309（A-G）号突变位点,可推测为南方苍蝇；若存在309（A-G），310（C-T）突变，可完成是昆明地区的推测；根据315（C-T）位置的突变，可推测为北方地区的苍蝇。进而将其应用到法医学的死亡地点推测。但是基于本研究样本数量有限这一客观因素，这些特异性的位点和单倍型是否可以用作死亡地点的推测，目前还不能得出确切结论，未来需要有足够的样本数量来支撑，而本文的目的在于为第一案发现场的推断从法医昆虫学的角度提供一种理论基础。

图1 前期实验和验证试验各位点突变详情