滑液干细胞对关节盘软骨细胞的作用研究*

邢 超 孙养鹏 张志光

颞下颌关节盘穿孔是临床常见的一类疾病，其临床主要表现为：张口受限、咬物痛、关节区弹响等，严重影响人们的生活。颞下颌关节盘是一种无血管的组织，其再生自我修复能力有限。目前对其治疗主要有局部理疗、热敷，药物治疗，咬合治疗，关节灌洗以及关节调压治疗。当保守治疗无效时，排除手术禁忌症后可手术切除关节盘或行关节盘复位修补术[1-3]。但是手术治疗与保守治疗的长期观察并未有明显的差异，临床会看到有些关节盘穿孔的患者通过保守治疗几年后复诊，关节盘穿孔部位出现修复愈合。Koyama[4]等人首次在颞下颌关节紊乱病患者的滑液中发现多潜能间充质细胞，体外实验研究表明，这类细胞可分化为软骨、骨、脂肪、神经组织。为了研究颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞(synovial fluid-derived mesenchymal stem cells,SFMSCs)在关节腔内的作用，我们引入条件培养基来观察人滑液来源的间充质干细胞与大鼠关节盘软骨细胞的相互作用，通过检测大鼠颞下颌关节盘软骨细胞生长、增殖以及特定的基因表达水平，初步探索这类细胞在关节腔内的作用。

1.材料与方法

1.1 实验动物与试剂 实验用SPF 级健康、雄性SD 大鼠，100g 左右,实验动物由中山大学北校区动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2011-0029，动物实验方法符合动物伦理学要求。低糖型DMEM、胎牛血清、PBS(Hyclone)，a-MEM、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 购自Gibico 公司，Anti-Collagen Type I Rabbit pAb 购于Calbiochem R○公司，Triton X-100、Anti-Collagen II,N-Terminal antibody produced in rabbit 从SIGMA-ALDRICHTM 公司购买，DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit gG(H+L)(EARTHoX.LLC·San Francaco CA·USA)，小牛血清、DEPC 水(MP Biomedicals)，DAPI(Cell Signaling)，CCK 试剂盒(泛博生化)，细胞周期分析试剂盒(联科生物Multisciences)，TRIzol R○Reagent(Ambion,Life Technologies)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，LightCycler R○480 SYBR Green Master(Roche)。

1.2 细胞培养与扩增

(1)人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞获取：中山大学光华口腔医学院附属口腔医院颞下颌关节病诊治中心就诊患者，实验前患者签署知情同意书，该项目获得中山大学光华口腔医学院附属医院伦理委员会批准。对需做造影检查的颞下颌关节紊乱病患者，8 号注射器关节上腔局部麻醉的同时注入1.5～2.0ml 利多卡因行关节上腔灌洗，收集注射器中的滑液[4]，300g/min 离心8min,加入含10%FBS 的alpha-MEM 转移至25cm2培养瓶中，48h 换液，利用干细胞的贴壁特性，分离提纯。大约2 周后细胞长满80%，1∶3 传代，成脂、成骨、成软骨确认其多向分化能力。

(2)大鼠颞下颌关节盘软骨细胞获取：取SPF级SD 大鼠，无菌条件下依次解剖周围皮肤、肌肉组织，血管钳离断分离下颌升支将髁突及其附着物取出，转移至超净台中。剥离周围附着肌肉，分离去净关节盘周边附着的滑膜组织。用眼科剪将分离出的关节盘剪至1mm3大小，放入乘有质量浓度为0.2%的I 型胶原酶的培养瓶中消化4h，离心弃上清液，PBS 冲洗再次离心弃上清液，转移至25cm2培养瓶中使用含10%FBS 的低糖型-DMEM 培养(L-DMEM)，3～4 天换液，待细胞长满培养瓶80%后传代[5]。

1.3 免疫荧光染色 取大鼠颞下颌关节盘软骨P1 代细胞，按5×103/皿，接种至激光共聚焦皿中，培养24h 待细胞贴壁后，PBS 轻轻冲洗，4%多聚甲醛-20℃下固定30min，PBS 冲洗干净加入0.3%Triton X-100 常温下透膜15min,PBS 洗净5%小牛血清(BSA)37℃封闭2h，I 型胶原抗体(1∶40)、II 型胶原抗体(1∶200)稀释相应倍数4℃过夜(＞16h)孵育一抗，37℃下孵育二抗1h，DAPI常温染色5min，激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及I 型胶原、II 型胶原荧光表达。

1.4 条件培养基制备 取P3 代SFMSCs 接种至75cm2培养瓶，待细胞长至70%体积时换新鲜培养液，培养24 小时后，收集上清液，700g 离心8min 去除细胞碎片，-80℃冻存备用。取解冻的上清液按照1∶2 体积比加入含10%FBS 新鲜的L-DMEM，制备条件培养基(SFMSC-CM)。

1.5 CCK-8 检测细胞生长情况 取P1 代大鼠颞下颌关节盘软骨细胞，按照3×103/孔接种至96 孔板，每组设置3 个复孔平行对照。大约6h 后细胞贴壁，轻轻的吸掉原有的培养基。实验组换用SFMSC-CM 每隔两天换液，对照组使用含10%FBS 的L-DMEM 每隔三天换液。分别于0、1、2、3 天避光条件下加入CCK-8 试剂，根据预实验摸索条件，1h 后酶标仪450nm 波长下检测吸光度(OD)值。

1.6 RT-PCR 检测相关基因表达情况 取P1代大鼠颞下颌关节盘软骨细胞，按照2×105密度接种至25cm2培养瓶中，每组设置3 个复孔平行对照。实验组加入SFMSC-CM 每隔2 天换液，对照组加入含10%FBS 的L-DMEM 每隔3 天换液。分别于7、14 天后收集样本，使用TRIzol®提取RNA。提取的样品测定浓度后，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录合成cDNA。反转录体系如下所示：取500ngRNA 样品1ul Oligo(dT18)primer，加入DEPC 水至12ul，65℃孵育5min 冰上冷却。依次加入4ul 5X Reaction Buffer、1ul RiboLock Rnase Inhibitor、2ul dNTP Mix、1ul RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase。42℃孵育60min，70℃孵育5min 终止反应。使用SYBR®Green QPCR Master Mix 试剂，在LightCycler®480(Roche)进行定量RT-PCR(qRT-PCR)。荧光定量PCR 反应体系如下：2ul DNA 样品加入正反向引物各1ul，DEPC 水6ul，SYBR 10ul。反应过程如下:95℃5min 前期孵育，95℃10s、60℃20s、72℃30s 扩增45 个循环，95℃5s、65℃1min、97℃持续，40℃30s 冷却。按照K.J.Livak 等人[6]的方法计算与对照组相对CT 值(2-△△CT)作为基因水平表达的改变。采用GAPDH 作为管家基因，分析I 型胶原、II 型胶原、X 型胶原基因表达情况，上述基因引物合成如表1 所示，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

图1 人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞形态观察及多向分化

表1 RT-PCR引物合成序列

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析，组间比较采用t 检验，P＜0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1 人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞形态学观察和三向诱导分化 如图1 所示：人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞(SFMSCs)显微镜下呈现纤维样形态(图1A)；人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞成骨诱导分化，Von Kossa's 矿化结节染色(图1B)；人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞软骨诱导分化，软骨块切片II 型胶原染色(图1C)；人颞下颌关节滑液来源的间充质干细胞成脂诱导分化，脂滴苏丹黑染色(图1D)。

2.2 大鼠颞下颌关节盘软骨细胞I 型、II 型胶原激光共聚焦显微镜观察 如图2 所示，激光共聚焦显微镜下可看的细胞胞浆内均有I 型、II 型胶原呈现绿色荧光表达，蓝色荧光为DAPI 核染色。激光共聚焦显微镜下I 型胶原、II 型胶原均有表达，验证获取的细胞为大鼠颞下颌关节盘软骨细胞。

图2 大鼠颞下颌关节盘软骨I、II 型胶原免疫荧光染色

图3 CCK-8 检测大鼠颞下颌关节盘软骨细胞0，24h，48h，72h 吸光度值

2.3 CCK-8 细胞增殖实验 如图3 所示，0，24h 时细胞吸光度值(OD 值)基本一致，表明细胞的增殖没有出现明显差异，48h，72h 实验组吸光度值明显高于对照组，P＜0.001 差异具有统计学意义，表明条件培养基组细胞增殖速度明显高于对照组。

2.4 大鼠颞下颌关节盘软骨细胞相关基因表达水平的变化 如图4 所示，第7 天，与对照组相比实验组中Col I 型胶原mRNA 的含量表达明显增加(图4A)，Col X 型胶原mRNA 的含量表达在实验组中出现明显降低(图4C)；第14 天，与对照组相比Col I 型胶原mRNA 含量在实验组中出现明显降低(图4A)，Col II 型胶原mRNA 含量在实验组中明显增加(图4B)，Col X 型胶原mRNA 的含量表达在实验组中出现明显降低(图4C)。

图4 大鼠颞下颌关节盘软骨细胞相关基因表达水平

3.讨论

对于关节盘的病变，Lanze 在1909 年首次报道摘除关节盘治疗TMD，但摘除关节盘后的髁突骨质可发生退行性改变，例如：骨摩擦音、关节结节吸收甚至出现纤维性关节强直。70 年代关节造影术的出现，明确证实了关节盘移位、穿孔的存在。随后，McCarty 对327 例关节盘移位穿孔修复术2 年追踪复查，成功率达到94%，开创了关节复位和修补术外科。但是关节盘穿孔手术治疗与保守治疗长期效果追踪并没有显示出明显的优势[7]。

间充质干细胞除了骨髓来源外，还存在于体内多种组织中比如：牙髓、牙周膜、颞下颌关节滑液等。临床及动物实验模型观察到这些细胞在损伤愈合中发挥重要的作用，它们不仅可以通过分化成不同的细胞调节修复进程，也可以通过与多种组织和细胞(纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞)相互作用提供组织组织再生和损伤修复的内环境[8]。有研究表明关节内出血、炎症、韧带断裂、关节盘穿孔可能会增加滑液中的干细胞数量[4,9]，但是对这类细胞在关节内的具体作用还不清楚。我们使用颞下颌关节滑液间充质干细胞制作条件培养基，CCK-8 细胞增殖实验表明SFMSC-CM 促进关节盘软骨细胞的增殖，该结果与之前在机体的其他器官例(脑、心脏、肾脏)[10]一致。

I 型胶原和II 型胶原是关节盘软骨细胞中常见的两种胶原，对于它们之间的含量变化，目前还没有得出明确的结论，一般认为I 型胶原的增加可能与软骨去分化有关[11]。通过RT-PCR 检测软骨相关基因的表达水平发现，I 型胶原在第7 天时实验组的表达量比对照组增加，然而14 天后对照组的表达量高于实验组。II 型胶原在第7 天时两组没有明显差异，第14 天后实验组表达量高于对照组。我们认为第7 天I 型胶原实验组含量的增加其原因可能是可能是细胞的增殖速度增加，软骨细胞出现去分化现象。第14 天时由于培养瓶的体积有限，细胞生长受到限制，细胞不再增殖，然而SFMSCCM 可能抑制软骨细胞去分化，因而出现I 型胶原表达量下降的现象，II 型胶原实验组的含量高于对照组。X 型胶原一般认为是细胞肥大的标识[11]，我们的实验观察第7 天、14 天时实验组含量均明显低于对照组，表明SFMSC-CM 通过抑制软骨细胞的X 型胶原表达，发挥抑制细胞肥大作用。

我们的实验通过体外条件培养基模拟颞下颌关节滑液中的干细胞分泌物，发现这些分泌物对关节盘软骨细胞具有促进增殖，RT-PCR 检测相关基因显示可以维持软骨细胞表型，抑制肥大。今后我们将进一步明确分泌物的作用通路及干细胞的迁移机制促使更多的干细胞参与关节盘穿孔的修复，为关节盘穿孔提供新的治疗方法。