基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体

胡骁飞，李青梅，姚静静，胡思宇，孙亚宁，邢云瑞，邓瑞广，张改平,

（1河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，郑州 450002；2河南农业大学生命科学学院，郑州 450002；3河南农业大学，郑州 450002）

0 引言

【研究意义】Alpha-玉米赤霉醇（α-zearalanol），又称玉米赤霉醇（zeranol, ZAL），化学名称为右环十四酮酚，霉菌毒素玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的还原产物[1]，是一种植物性雌激素，能提高植物抗寒抗冻能力及冬小麦的春化[2]。上世纪60年代发现其有促进反刍动物体内蛋白质沉积的功能，提高牛羊饲料转化效率，缩短牛羊育肥周期，因此被作为反刍动物促生长剂而广泛应用，尤其是采用埋置形式[3-4]。随后的研究证明ZAL对单胃动物如大鼠、狗及猴子是有害的，特别是生殖方面危害[5-8]。虽然ZAL在体内大部分会被代谢掉，但仍有一部分会残留在埋置部位。而且通过食物链食用含有ZAL残留的牛羊肉后，导致消费者促性腺激素水平的降低、内分泌失调、生长发育障碍以及影响人体第二性征发育等不良影响，而且还具有潜在的致癌、致畸、致突变等毒性[9-12]。1996年，欧盟明确禁止在畜禽养殖中使用ZAL，同时要求向欧盟各国输入的畜牧产品中不得检出其残留物[4]。2002年，我国农业部第193号公告中明确禁止ZAL作为增重剂用于任何食源性动物，并且在食源性动物的任何可食组织中均不得检测到。但是由于ZAL作为牛羊增重剂增重效果好、经济回报高等特点，仍被非法使用。【前人研究进展】为了减少ZAL危害，人们建立很多种ZAL检测方法。目前常用的检测方法包括理化法如（高效）液相色谱及其衍生方法[13-19]，气液相色谱及其衍生方法[20-23]，薄层色谱及其衍生的方法等[24-25]。免疫学检测方法如放射免疫分析法（RIA）、ELISA、荧光免疫分析（FIA）、化学发光免疫分析（CLIA）及免疫传感器（Immunosensor）[4,26]。理化检测方法虽然准确、灵敏度高，但耗时长，费用高。而免疫学检测方法简单，灵敏度高，特异性强，耗时短，费用低，使用便捷，可进行大批量筛检，因而近些年免疫学检测方法得到快速发展，刘媛等利用玉米赤霉醇单克隆抗体建立ZAL的免疫检测方法[27]。【本研究切入点】决定免疫学检测方法灵敏度的关键是抗体的质量，目前有关报道ZAL免疫学检测抗体灵敏度均是ng级，有的甚至是更高[27-28]，可能是因为ZAL人工抗原的质量不确定，在制备人工抗原过程中完全或部分改变了ZAL的抗原决定簇，因此导致制备的抗体灵敏度不高，甚至可能并不是ZAL的抗体。【拟解决的关键问题】本研究针对现有的ZAL抗体制备存在的不足，从抗原制备源头开始，拟通过利用抗体的非特异性反应（交叉反应性），利用ZAL结构类似物玉米赤霉酮（ZAN）制备抗原，然后免疫动物，在抗血清及细胞培养上清抗体灵敏度检测时，以ZAL为阻断剂，从而筛选能分泌抗ZAL单抗的杂交瘤细胞株，建立一种ZAL抗体制备新方法，为高灵敏的ZAL免疫学检测方法研发奠定基础。

1 材料与方法

本试验于2014—2017年在河南省农业科学院动物免疫学重点实验室完成。

1.1 试剂

α-玉米赤霉醇（ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZEL）、玉米赤霉酮（ZAN）、玉米赤霉烯酮（ZEN）及黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）标准品、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）、非那西丁、过氧化脲购自于Sigma-Aldrich公司。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、伏马菌素B1（FB1）、T-2毒素及呕吐毒素（Deoxynivalenol, DON）标准品、EDC[1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺由Thermo scientific公司生产；弗氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant, FCA）及弗氏不完全佐剂（Freund's incomplete adjuvant, FIA）购自于Pierce公司；羧甲基羟胺半盐酸盐（CMO）购自日本东京化成工业株式会社；酶标记二抗（羊抗鼠IgG抗体，GaMIgG-HRP）购自华美生物工程有限公司；ZEN 单克隆抗体，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备；3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺（TMB）等其他试剂均购自于市售，均为国产分析纯或更高级别试剂。

1.2 溶液

0.01 mol·L-1，pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS），实验室自配，室温保存（注：用于动物免疫时必须经高压灭菌处理）。0.05 mol·L-1，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS），实验室自配，室温保存。ELISA实验洗液PBST，PBS+0.05% Tween-20，实验室自配，室温保存。显色液A，含有非那西丁及过氧化脲的0.1 mol·L-1pH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液，冷藏避光保存；显色液B，含有TMB的等量甲醇与甘油混合溶液，实验室自配；使用时显色液A和显色液B等量混合均匀。终止液：2 mol·L-1硫酸溶液，实验室自配。

1.3 实验动物及细胞系

SPF级6周龄雌性BALB/c小鼠，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室实验动物中心繁殖饲养。细胞融合所用NS0细胞系，英国动物健康研究院惠赠，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室传代培养。

1.4 试验方法

1.4.1 ZAN人工抗原制备 2 mg ZAN 溶于2 mL无水吡啶，加入4 mg CMO，旋转蒸发仪上（115℃）控温回流2 h，旋转蒸发干燥，2 mL甲醇（每次1 mL，洗涤2次）洗涤干燥物，旋干；1 mL双蒸水（DDW）溶解制备所得物，2 mol·L-1NaOH调节溶液pH值到8.0；等体积甲苯抽提3次，弃甲苯层，留水相层；水相用等体积乙酸乙酯萃取3次，弃水相，留乙酸乙酯相，旋干，得到ZAN-O。ZAN肟化改造路线见图1。

0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解上述ZAN-O，转移至有转子的平底玻璃瓶，0.5 mL DMF洗涤旋转瓶，溶液转移至上述玻璃瓶中，磁力搅拌器上搅动的同时向玻璃瓶加入2 mg EDC和1.2 mg NHS，室温搅拌2 h，记为A液。

称取5 mg BSA于放置有转子的平底玻璃瓶中，加入500 μL 0.3% NaHCO3，记为B液。磁力搅拌器上，边搅拌边缓慢加入A液，室温搅拌反应2 h。

将上述溶液装入制备好的透析袋内，对PBS透析3 d，第一天换透析液8次，第二天换透析液6次，第三天换透析液4次，得到ZAN-O-BSA。

分别称取和上述一样质量的ZAN，EDC，NHS，和BSA一样质量的OVA（提前1天把OVA溶解于0.3%NaHCO3），采用与上述相同的方法，制备出ZAN-O-OVA。

图1 ZAN 肟化改造路线图Fig.1 Roadmap of ZAN structural renovation by oximation

1.4.2 人工抗原的质量鉴定 采用河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备的ZEN单克隆抗体对所制备的人工抗原进行鉴定。制备的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA分别用CBS稀释到4 μg·mL-1，分别包被酶标板，并采用5%（v/v）猪血清封闭酶标板，制备出ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA酶标板。间接ELISA测定ZEN单抗效价[ZEN单抗先用PBS稀释到1∶5 000（v/v）]，酶标板上的孔先分别加入50 μL PBS，然后第一孔加入50 μL上述制备的单抗溶液，移液枪吹打混匀后，取出50 μL加入到第二孔，吹打混匀，取出50 μL加入到第三孔，同样的方法，一直倍比稀释到第七孔，混匀后，取出50 μL弃掉，第八孔作为空白（BC）对照孔；37℃恒温箱孵育15 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入PBS 1∶1000倍（v/v）稀释的HRP标记的抗IgG抗体50 μL/孔，37℃恒温箱孵育30 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入显色液50 μL/孔，室温孵育10 min，每孔加入50 μL终止液，酶标仪450 nm滤光片读值（OD450）。根据ZEN效价的有无确定抗原制备是否成功。

1.4.3 动物免疫及免疫效果测定

1.4.3.1 动物免疫 选取健康的SPF级6周龄雌性BALB/c小鼠6只，用ZAN-O-BSA进行免疫。免疫剂量50 μg蛋白/（200 μL·只老鼠）；采用背部皮下的免疫方式，4—6个点注射；共免疫4次；间隔3—4周。第一次免疫时，用PBS稀释ZAN-O-BSA到100 μg蛋白/200 μL，加入等量的FCA，充分乳化后（取乳化好的乳液一滴，置于水面上，乳滴浮在水面上且不发生扩散，证明乳化完全）注射入BALB/c小鼠皮下。后3次强化免疫时，把FCA改换为FIA即可，其他试剂及程序不变。

1.4.3.2 免疫效果测定 四免10 d后，断尾采血10 μL，加入到990 μL PBS中，5 000 r/min离心10 min，弃沉淀留上清用于血清效价和灵敏度（即半数抑制浓度，IC50）测定。ZAN-O-OVA 2 μg·mL-1包被酶标板，5%（v/v）猪血清封闭酶标板。间接ELISA测定血清效价，步骤同1.4.2中ZEN单抗效价测定；结果判定时，P/N≥2.1（待测孔OD450/BC孔OD450≥2.1）且待测孔 OD450≥0.2，则判定为阳性孔。间接竞争（阻断）ELISA测定血清灵敏度时，ZAL作为竞争物与酶标板上包被的ZAN-O -OVA竞争结合血清抗体，把浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 ng·mL-1的ZAL标准液，按50 μL/孔分别加入到酶标板孔中，然后每孔再加入50 μL血清（血清最终稀释倍数是效价测定时，OD450值最为接近于1.0时对应的稀释值），后面的试验步骤与效价测定完全一致。

1.4.4 ZAL单抗制备及免疫学性能鉴定

1.4.4.1 阳性杂交瘤筛选 选取小鼠血清效价高，灵敏度好，即IC50值比较小的小鼠作为细胞融合用小鼠。高压无菌处理的PBS稀释ZAN-O-BSA至50 μg蛋白/200 μL，不加佐剂，直接注射到用于细胞融合的小鼠腹腔中进行超强免疫。3 d后，摘取眼球放血，抻颈处死小鼠，小鼠尸体置于75%酒精中浸泡5 min。超净台上无菌取小鼠脾脏与NS0细胞进行融合。细胞融合过程按孙亚宁[29]描述进行，小鼠脾脏细胞与NS0细胞融合后，均匀的融合细胞悬液按100 µL/孔分别加入到96孔酶标板上，共铺10块酶标板，960个孔，放于37℃、5% CO2培养箱中。阳性杂交瘤细胞筛选过程按胡骁飞等[30]描述进行，间接ELISA测定细胞上清效价，阻断ELISA测定细胞上清灵敏度。最终选效价高、灵敏度好、细胞生长旺盛的孔，转入24孔培养板中扩大培养后进行2次有限稀释亚克隆化，然后扩大培养、建株、反复冻存与复苏，最后筛选到能稳定分泌抗ZAL单克隆抗体的细胞株。收集的眼球血液37℃恒温箱静置2 h，5 000 r/min，离心10 min，收集上层阳性血清，-20℃保存，作为阳性对照血清，在细胞融合筛选时使用。

1.4.4.2 腹水制备 体内诱生腹水法批量制备抗体。向小鼠体内注入石蜡400 µL/只以诱发炎症，7—10 d后注入制备好的杂交瘤细胞，观察小鼠腹部变化，一般小鼠在注射10 d左右，小鼠腹腔变大，小鼠腹腔皮肤紧绷时，用消毒的大号针头刺破腹腔，收集腹腔液体即为腹水。

1.4.4.3 单抗免疫学性能鉴定 采用one dropTM光谱仪测定单抗蛋白浓度。

间接ELISA测定单抗效价，步骤同1.4.3.2中血清效价测定。

间接竞争ELISA测定单抗灵敏度，步骤同1.4.3.2中血清灵敏度测定。

间接竞争ELISA测定单抗特异性，把竞争物替换为ZAL的结构类似物、其他霉菌毒素以及人工抗原制备时所用的载体蛋白BSA和OVA，不同的竞争为物质的浓度不同。

亲和力曲线测定按照姚静静等[31]描述方法稍作改动。PBS稀释ZAN-O-OVA成0.5 µg·mL-1和1 µg·mL-1两个浓度进行包板。PBS稀释单抗蛋白至128 µg·mL-1。在两个ZAN-O-OVA浓度包被的酶标板上，分别加入倍比稀释上述已知质量浓度的单抗，测定OD450值，以OD450为横坐标，单抗浓度为横坐标，建立亲和力曲线。根据亲和力常数计算公式，计算亲和力常数Ka值[32]。

2 结果

2.1 人工抗原质量分析

紫外扫描测定ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA的浓度分别为5.78和8.9 mg·mL-1。CBS分别把二者稀释到4 μg·mL-1包板，测定ZEN单克隆抗体的效价，结果见表1。从表1可以看出，ZAN-O-BSA及ZAN-OOVA包被的酶标板均能测定出ZEN单抗的效价，且随着抗体浓度的降低，OD450值呈现逐渐下降的趋势，说明制备的人工抗原时与ZEN抗体可以结合，人工抗原制备是成功的。

2.2 融合小鼠的筛选

小鼠血清效价测定结果见表2，表明ZAN-O -BSA免疫小鼠后能够刺激机体产生抗体。血清灵敏度测定结果见表3，从表3可以看出，6只免疫ZAN-O-BSA的小鼠均能产生抗ZAL抗体，500 ng·mL-1以下浓度的ZAL可以或强或弱地抑制ZAN与血清抗体的结合。其中6号小鼠血清灵敏度最好，通过拟合标准曲线（图2），可以计算得出IC50为40.04 ng·mL-1，因此选择6号小鼠作为融合小鼠。

2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选

细胞融合3 d后观察酶标板，发现其中898孔有细胞生长，其余62个孔没有看见细胞生长，即93.54%细胞孔有细胞生长，说明细胞融合率比较高。待融合细胞生长至覆盖培养孔1/3孔底面积时，将培养细胞板各孔的细胞上清取出25 μL，加入到每孔含有25 μL PBS的ZAN-O-OVA包被的酶标板孔中，间接ELISA测定细胞上清OD450值，OD450值在1.0以上的认为是阳性孔，共有44孔，阳性孔率为4.58%，以5、2 ng·mL-1两个浓度ZAL测定44个阳性孔细胞上清液的灵敏度，其中2孔细胞上清IC50在2 ng·mL-1以下。将这2孔细胞转至24孔酶标板扩大培养亚克隆，用1 ng·mL-1ZAL测定细胞上清液的灵敏度，选择IC50在1 ng·mL-1以下阳性孔，最终得到一株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株12B10A7。

图2 6号免疫小鼠血清抑制曲线图Fig.2 The serum inhibition curve of NO.6 immunized mouse

表1 制备的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA 包板测定ZEN单克隆抗体效价Table 1 The ZEN McAb’s titer detected by microplates coated with the prepared ZAN-O-BSA or ZAN-O-OVA

表2 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清抗体效价Table 2 The serum titer of mice immunized with ZAN-O-BSA

表3 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清灵敏度Table 3 The serum sensitivity of mice immunized with ZAN-O-BSA

2.4 单抗性能鉴定

光谱仪测定单抗蛋白浓度约为20.29 mg·mL-1。间接ELISA测定单抗效价为2.56×105，结果见表4。

间接竞争ELISA测定了单抗腹水的灵敏度，其抑制曲线见图3，线性方程为y=-0.5483x+0.3691，相关系数R2=0.9666，通过公式计算IC50为0.577 ng·mL-1。

单抗特异性鉴定结果见表5，从结果可以看出，所制备的单克隆抗体除了与α-ZAL反应外，与ZAN有77.65%的交叉反应率，与β-ZAL有43.06%的交叉反应率，与α-ZEL和β-ZEL分别有15%左右的交叉反应率，与ZEN有近10%的交叉反应率，与其他霉菌毒素如AFB1、OTA、FB1、T-2毒素、DON以及载体蛋白BSA、OVA交叉反应率均小于0.1%。

表4 ZAL单抗效价Table 4 The titer of ZAL McAb

表5 ZAL单抗特异性Table 5 The specificity of ZAL McAb

图3 ZAL单抗的抑制曲线图Fig.3 The serum inhibition curve of ZAL McAb

亲和力曲线测定如图4。ZAL mAb与抗原结合达半饱和时对应ZAL mAb的浓度分别是9.04×10-9和8.54×10-9mol·L-1，将所得的值换算成摩尔浓度值带进公式得Ka为6.21×107L·mol-1。GODING认为，亲和常数为107—1012L·mol-1时表明抗体具有高亲和力[33]，因此本试验获得了高亲和力的ZAL mAb。

图4 ZAL单抗亲和曲线Fig.4 The affinity curve of ZAL McAb

3 讨论

ZAN分子量为320.38，属小分子半抗原物质，由于其自身结构简单，只具有免疫反应性，可以与相应的抗体结合；但不具有免疫原性，因此不能直接刺激机体产生相应的抗体，必须与大分子的载体物质如BSA，OVA，匙孔血蓝蛋白（KLH，Keyhole limpet hemocyanin）或非抗原性的多聚赖氨酸等偶联后，才能具有免疫原性，通过刺激动物机体产生针对ZAN的抗体。小分子与载体蛋白偶联是否成功需要进行质量鉴定，鉴定方法一般包括紫外扫描鉴定、凝胶电泳鉴定、红外光谱法（IR）鉴定、质谱鉴定及动物免疫鉴定[34-35]。紫外扫描、凝胶电泳、红外光谱及质谱鉴定只是根据物质特征吸收峰有无变化、载体蛋白分子质量变化情况来初步判定半抗原与载体蛋白是否偶联在一起，但不能确定偶联方式是否正确，也即偶联过程中是否对半抗原的特征结构（半抗原的抗原决定簇）产生影响，如果偶联过程中半抗原的抗原决定簇被破坏，则即使半抗原与载体蛋白偶联在一起，即使能刺激动物机体产生抗体，但所产生的抗体并不是针对半抗原的抗体。因此，半抗原与载体蛋白偶联是否成功，是否能刺激机体产生针对半抗原的抗体，最好的方法是通过免疫动物来确定，或者用已知的半抗原的抗体来确定。我们以前的研究发现，制备的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与玉米赤霉酮有交叉反应性，但和BSA及OVA没有交叉反应性[36]，因此，本研究中用制备的ZAN-O-BAS及ZAN-O-OVA包板测定ZEN抗体效价，以确定ZAN是否与BSA及OVA正确偶联，而结果两个人工抗原均能测定到ZEN抗体效价，说明本研究中的偶联方法正确，且制备的人工抗原是成功的，制备过程并没有改变ZAN的抗原决定簇，为后面抗体的制备奠定了良好的基础。

半抗原、抗原和抗体之间的特异性结合，其分子机制是抗原分子表面存在着能与抗体相互作用的部位即抗原决定簇，是抗原表位的空间结构与抗体分子超变区互补以及氢键、疏水性、静电作用等形成的低能势共同作用的结果[37]，也即抗体是从抗原决定簇的立体结构而不是从抗原的全面分子排列来“认识”抗原的，因此，半抗原分子的空间构像对抗体免疫学特性有决定性影响，半抗原分子改造或偶联过程中如果空间结构发生变化，则很可能制备不出所需要的抗体。

交叉反应性是指抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应，交叉反应实质上也是抗原与抗体的特异性结合。交叉反应通常发生在含有相同结构，特别是相同空间结构的半抗原之间，也可发生于具有相似抗原决定簇或相似结构部位的半抗原之间[38]。ZAL及ZAN均属于小分子化合物，根据分子抗原决定簇数目计算公式，分子量小于1万，抗原决定簇只有1个[39]。ZAN和ZAL二者只是在七位碳原子上的结构（结构式见表4）有所不同，ZAL的C7位碳原子为羟基，而ZAN为酮基，二者的抗原决定簇可能有一定的交叉重合，因此产生交叉反应性。以前的研究证明ZEN抗体与ZAN及ZAL有一定的交叉反应[36]，说明三者的抗原决定簇至少有部分是重叠的。从ZEN结构上分析可以看出ZEN中C11-C12位点双键肯定是抗原决定簇的一部分，同时C7位点的结构也应该是抗原决定簇一部分，可能正是由于这两个部位结构的不同，导致ZEN单抗与ZAN及ZAL交叉反应率的不同，也导致本试验中制备的ZAL单抗与ZEN及ZAL交叉反应率的不同。

笔者以往在对ZAL苯环上的羟基进行改造制备人工抗原时，可能是破坏了或至少是部分破坏了抗原决定簇，因此导致制备的抗体灵敏度不高，甚至制备的抗体可能不是真正的ZAL抗体，因此用ZAL阻断ZAL-O-OVA与ZAL-O-BSA免疫动物产生的抗体反应时，并没有见到阻断作用或阻断效果不好。而用ZAN肟化改造C7位的酮基时，改造后其结构与ZAL结构比较相似，可能抗原决定簇比较吻合，因此ZAN-O-BSA免疫动物产生的抗体，可以与ZAL反应，而且反应灵敏度比较高。

本研究制备的ZAL抗体与其结构类似物（β-ZAL、α-ZEL、β-ZEL、ZAN、ZEN）有或多或少的交叉反应性，用此抗体建立ZAL免疫学检测方法进行样品检测时，即使样品中不含ZAL，而含有其结构类似物，检测结果也可能是阳性。由于玉米赤霉醇结构类似物也基本都是有害的，如果建立的检测方法能够检测到，则更有利于对玉米赤霉醇的监控。我国农业部2012年10月1日开始实行的《农产品质量安全监测管理办法》明确规定，可以采用快速检测方法对样品进行筛查，然后再通过国家标准的理化检测方法进行确证，可以保证对玉米赤霉醇检测不会出现假阴性结果，而避免漏检。

4 结论

利用制备的人工抗原ZAN-O-BSA免疫动物产生抗血清，玉米赤霉醇作为检测靶标物，通过阻断ELISA筛选，筛选出分泌抗玉米赤霉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞，并制备出玉米赤霉醇单克隆抗体，该抗体灵敏度高IC50为577 pg·mL-1，亲和力强。基于所本研究所制备的单克隆抗体，可以建立玉米赤霉醇酶联免疫、化学发光、时间分辨、荧光偏振等免疫学检测方法，并可制备玉米赤霉醇胶体金试纸条及拉曼增强胶体金试纸条等快速检测产品。