猪膀胱脱细胞基质制备的实验研究

邓 飞，胡帼颖，顾汉卿

(1.北京市顺义区医院泌尿外科，北京101300；2.天津市泌尿外科研究所，天津300211)

膀胱大面积缺损由肿瘤、结核等原因引起的是临床难题。胃肠道替代膀胱是目前最常用的方法，该方法不仅造成供区的创伤，而且还存在许多并发症。近年来，随着组织工程技术的发展，通过脱细胞方法，可以将产生于膀胱的膀胱粘膜下基质作为细胞支架，再生膀胱组织，以达到修复及扩大膀胱的目的，去除膀胱内细胞、抗原等成分，使其表面光滑，结构相对致密，有利于尿路上皮的粘附，且能有效阻止尿液渗入腹腔。研究者为了寻找能完全再生而无不良反应的扩大及替代膀胱的材料，已经进行了多年的研究。Meezan的脱大鼠膀胱组织的方法是最早报道的，后来的许多研究都是基于这一方法。猪与大鼠的膀胱组织不同，其膀胱平滑肌纤维较厚、粗大、机械强度高、脱细胞技术要求高，使用Meezan方法不能制备出合格的猪膀胱脱细胞基质，以Meezan方法为对照组。本实验采用改进的Meezan的方法作为实验组，制备出符合脱细胞技术要求的猪膀胱脱细胞基质。

1 材料和方法

1.1 试剂

牛胰脱氧核糖核酸酶-I(DNAse-I)，牛胰核糖核酸酶-A(RNAse A)，脱氧胆酸钠，叠氮钠。

1.2 仪器与材料

恒温磁力搅拌器，电热式蒸汽消毒器，生物显微镜，手术相关器械，微孔滤膜滤器，微孔滤膜(膜孔=0.2 μm)等。

1.3 溶液配制

(1)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU溶液:NaCl 11.7 g，加入200 mL三蒸水，完全溶解混匀分装，高温高压蒸汽消毒灭菌。称量DNAse-I 3.2 mg，(600 ～1 000 kU/mg)，加入灭菌的200 mL 1 mol/L NaCl溶液中，4℃保存备用。(2)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU、RNAse 2 000 kU溶液:称量 DNAse-I 3.2 mg，RNAse 5 mg(400 kU/mg)，加入灭菌的200 mL 1mol/L NaCl溶液中，4℃保存备用。(3)磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液:NaCl 8.00 g/L，KCl 0.20 g/L，NaHPO1.56 g/L，KHPO0.20 g/L，将混匀的PBS溶液分装盐水瓶内，高温蒸汽消毒灭菌，三蒸水配制7.4% NaHCO溶液1 000 mL，微孔滤膜过滤除菌，用NaHCO溶液调节PBS溶液pH值为7.2～7.4，4℃保存备用。(4)配制4%脱氧胆酸钠和100 mL 0.1%叠氮钠溶液:分别称量脱氧胆酸钠4 g和叠氮钠0.1 g，放入100 mL三蒸水中，充分混匀，4℃保存备用。

1.4 制备方法

1.4.1 取材与预处理方法 医用实验级小型猪为取材动物，体重约25 kg。手术当天，使用静脉注射氯胺酮方法麻醉，猪翻身至仰卧位，取下腹部正中切口。手术区碘酒酒精消毒，纵切皮肤、皮下脂肪层和肌肉层，拉开两侧肌肉，腹膜显露。切开腹膜后，进入腹腔，分开肠管，可见盆腔内充盈的膀胱，分离膀胱周围的筋膜组织，找到两侧的输尿管连接部及膀胱颈，在此结扎切开，取下完整的膀胱。把膀胱尿液放尽，从中部纵行剪开膀胱，露出内腔面，可见膀胱内面的粘膜层，用PBS溶液反复冲洗膀胱。在0.1%叠氮钠-PBS溶液中保存，加入预处理后的膀胱双抗抗菌溶液，密封，4℃保存备用。

1.4.2 猪膀胱脱细胞基质的制备

1.4.2.1 对照组:Meezan方法。取出预处理后的膀胱，用刀片刮去膀胱粘膜层，保留粘膜下的肌层及浆膜层，用PBS溶液反复冲洗3次后放在200 mL 1 mol/L NaCl含2 000 kU DNAse溶液中，放置在恒温振荡器内，保持37℃，转速150次/min，时间10 h后取出，PBS溶液反复清洗3次后，放在100 mL 4%脱氧胆酸钠溶液中，37℃，恒温振荡，转速150次/min，时间10 h。共进行2次，PBS溶液反复清洗3次。取出0.5 cm×0.5 cm左右的基质，PBS溶液冲洗，福尔马林溶液固定，行病理切片，HE染色。将制备的基质储存于0.1%叠氮钠-PBS溶液中，加入双抗溶液，密封，4℃保存。

1.4.2.2 试验组:本试验改进方法。方法步骤同上，只是处理后的膀胱放入200 mL 1mol/L NaCl含2 000 kU DNAse和2 000 kU RNAse溶液中。

2 结果

2.1 正常的猪膀胱粘膜下组织病理切片结果

参见图1。结果显示，平滑肌组织的纤维结构，其间有细胞存在，成簇分布。

图1 正常猪膀胱粘膜下组织病理切片结果

2.2 对照组Meezan方法病理切片结果

参见图2。结果显示，排列整齐的胶原纤维，细胞顺纤维方向均匀分布，细胞仍大量存在。

图2 Meezan方法病理切片结果

2.3 实验组改进的方法病理切片结果

参见图3。结果显示，胶原纤维排列整齐，无细胞出现，也无细胞碎片存在，但细胞脱去后仍可见到结构。因此，制备的猪膀胱脱细胞基质符合脱细胞技术要求。

图3 本试验方法病理切片结果

3 讨论

Meezan最早报道的大鼠膀胱脱细胞基质支架制备方法:将大鼠膀胱置于35 mm培养皿中，加入50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%的叠氮钠溶液。膀胱粘膜层用刀片刮去，留下平滑的肌层和浆膜层，用50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%叠氮钠溶液处理，搅拌5～6 h。用40 mL PBS溶液冲洗后，再用含2 000 kU DNAse的50 mL 1 mol/L NaCl溶液处理，搅拌6～8 h。再用0.1%叠氮钠-4%脱氧胆酸钠溶液50 mL处理，搅拌5～6 h，必要时可重复搅拌1次。制成的基质使用PBS溶液清洗，储存在40%的硫酸新霉素中，密封，4℃保存。Wu等类似于 Meezan的方法，从成年 Sprague Dawley鼠取出膀胱，放入蒸馏水中搅动1 h，使细胞水解。接着用4%脱氧胆酸钠溶液作用2～4 h，最后放在2000 kU DNAse-I的1 mol/L NaCl的溶液中作用2 h。将BAM置于PBS溶液中，温度4℃。这种方法的特点是和Meezan方法次序互换，制备时间缩短。

近年来，为避免使用人工合成材料或非泌尿系组织替代材料所带来的并发症，研究人员积极尝试利用天然细胞外基质进行膀胱的修补与替代，采用基质移植膀胱脱细胞化的方法进行膀胱组织的替代重建，并且在动物实验方面取得了可喜的研究成果。膀胱脱细胞基质是利用生物酶和相关试剂除去膀胱组织中的细胞和细胞碎片，留下细胞外基质，成为无细胞和富含胶原、弹性蛋白、平滑肌结构、血管框架的基质。这种材料具有良好的生物相容性和机械稳定性，可以作为细胞支架用于新生膀胱组织的生长替代重建，完成膀胱缺损的修补、成形、重建，完成膀胱的储尿和排尿功能。Piechota等研究认为，膀胱脱细胞基质移植物能完全再生膀胱壁的所有成分，体外实验研究再生的膀胱平滑肌纤维束与宿主的膀胱平滑肌纤维束相比，收缩力高达50%左右。Probst等使用膀胱脱细胞基质移植物用于膀胱扩大术，由于材料取自膀胱组织，类似于宿主膀胱的机械性能、结构和遗传特性，经处理后又明显降低了抗原性，移植效果相当满意。膀胱脱细胞基质移植物在同种异体和异种移植中的良好表现及简单的制备过程，将推动其在未来的临床应用。

本研究首先采用Meezan的方法制备膀胱脱细胞基质，由图2可见脱细胞效果不佳，且残留细胞较多。分析失败原因可能因为猪与大鼠的膀胱组织不同，猪的膀胱平滑肌纤维更厚实粗大，机械强度高，脱细胞技术要求高，不能制得合格的猪膀胱脱细胞基质。我们根据文献报道血管脱细胞基质的制备方法，结合猪膀胱组织的特点，在生物酶解液中加入了RNAse，配合DNAse的酶解作用，并且把膀胱制成组织片断，便于生物酶进入到组织内部，进行实验。温度维持在37℃，有利于最大程度发挥酶解作用。病理切片(图3)显示，基质内脱去了细胞及细胞碎片，只留下排列稀疏的纤维组织，纤维之间有许多空穴，而且顺纤维方向排列，推测可能是细胞在不断搅动震荡时，细胞顺纤维方向重新分布，当用脱氧胆酸钠脱去细胞膜和细胞内的脂质，细胞被破坏分解进入到清洗液中，细胞脱去后就在基质留下空穴。对比图2和图3，可见图2的细胞顺纤维分布，图3中相应的区域有明显的空穴，可以证明判断的正确性。

不仅我们的研究发现Meezan的方法不能制得合格的猪膀胱脱细胞基质。许多研究者也有同样的结论，对制备方法进行了改变，主要是针对猪膀胱脱细胞基质制备的高技术难题。如Merguerian等报道的猪膀胱脱细胞基质制备方法。整个膀胱最先放在三羟甲基氨基甲烷(Tris)/KCl/EDTA和1% Triton溶液中，后放入Trizma/EDTA溶液中。然后用配备的DNAse和RNAse溶液处理后，在Tris/SDS溶液中搅动。SDS提取后，放在70%乙醇溶液中，存储在Dulbecco's PBS溶液中，放入冰箱中。另外，Brown等的方法要求更高，其材料来自屠宰场的猪，因此脱细胞技术含量更高。在30 min内，从猪体内迅速取出膀胱，进行一系列脱细胞技术处理。整个膀胱放在低渗的Tris缓冲液中(pH=8.0)，含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，浓度为0.35 mL/L，室温下不断搅动48 h。接着放在含有1% Triton X-100和蛋白酶抑制剂的tris缓冲液，持续搅拌48 h。取出膀胱，PBS溶液清洗30 min后，室温下使用DNAse和RNAse作用10 h。再次用PBS溶液清洗，使用含有SDS的Tris缓冲液完成进一步脱细胞过程，时间为48 h。放入PBS溶液24 h后，制备的基质再用70%的乙醇消毒后使用。

我们在制备方法中，结合了Merguerian PA和Brown AL方法的特点，但他们方法步骤较多，时间长。我们将整个制备过程分为4个质量控制环节:PBS溶液水解细胞、生物酶分解细胞内成分、清除细胞脂质和PBS溶液清洗。我们在制备方法上，在Meezan方法基础上，在 DNAse酶解过程中加入RNAse，病理切片显示基质内无细胞及细胞碎片，获得了合格的膀胱脱细胞基质。

综上所述，本实验通过使用200 mL 1mol/L NaCl含DNAse-I 2 000 kU和RNAse 2 000 kU溶液，将处理后的膀胱粘膜下基质，在37℃恒温振荡10 h，转速150次/min，PBS溶液反复清洗3次后放在100 mL 4%脱氧胆酸钠溶液中，37℃恒温振荡10 h，转速150次/min，进行2次，PBS溶液反复清洗3次，制备出猪膀胱脱细胞基质，满足了脱细胞要求，可以作为支架用于动物移植的实验研究。