不同产地鸦胆子球蛋白源生物肽体外抗黑色素瘤活性研究△

王惠芸，陈佩瑶，欧阳雨晴，王冬，王灵芝*

1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 100029；2.北京中医药大学 中医学院，北京 100029

鸦胆子是苦木科植物鸦胆子属鸦胆子Bruceajavanica(L.) Merr.的干燥成熟果实，味苦，性寒，有小毒，归大肠、肝经，具有清热解毒、治疟、治痣等功效，主产于广东、广西、云南、福建等地[1]。抗肿瘤是鸦胆子最显著的药理作用之一，其中鸦胆子油及苦木内酯类化合物为重要有效成分[2-3]，目前鸦胆子油已广泛应用于胃癌[4]、非小细胞肺癌[5]、宫颈癌[6]、大肠癌[7]、肝癌[8]等疾病的治疗。生物肽在体内发挥着重要的生理调节作用，肽类药物具有分子量小、对肿瘤敏感、成本低等传统化疗药物和大分子抗体药物所不具备的特点，因而成为近年来国内外研究热点[9]。该类药物可通过免疫调节、抑制肿瘤血管生成、促进细胞凋亡、影响细胞周期、抑制细胞内信号传导等机制来发挥抗肿瘤作用[10]。课题组前期研究表明鸦胆子球蛋白源生物肽可抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖[11]。不同地理位置、气候条件等对中药材质量和功效均有一定程度的影响，产地对鸦胆子蛋白质品质及相关药理作用是否存在影响，尚未见详细报道，本研究拟对其进行系统研究，并对其球蛋白源小分子肽的细胞毒性进行评价。

1 材料与仪器

1.1 材料

鸦胆子分别采购自广东、广西、云南、福建4个产地，产地信息见表1，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Bruceajavanica(L.) Merr.的干燥成熟果实。

表1 不同产地鸦胆子来源

1.2 试剂

胃蛋白酶(批号：101644990，Sigma)；DMEM培养基(批号：1830761，Gibco)；FBS(批号：9080763，Vistech)；双抗(批号：30002283，Corning)；蛋白质标准品(批号：00544005，普科利莱)。所有化学试剂均为分析纯。

1.3 仪器

FW-100型高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；BP221S型电子分析天平(Sartorius公司)；全自动旋光仪(美国鲁道夫公司)；TGL-20M型台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；GTR10-2型高速冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；FD-50冷冻干燥机(上海比朗仪器制造有限公司)；DL-CJ-1N高性能无菌工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；MCO-18AIC(UV)CO2培养箱(日本SANYO公司)；Epoch酶标仪(美国Bio-Tek公司)；TE2000-S倒置显微镜(日本NIKON公司)。

2 方法

2.1 鸦胆子主成分含量测定

2.1.1蛋白质含量和纯度测定 采用凯氏定氮法[12]96：不同产地的鸦胆子粉碎后，过四号筛。精密称定鸦胆子粉末或量取蛋白溶液于凯式烧瓶中，依次加入浓硫酸和催化剂进行消化直至终点，消化液定容后，取适量溶液进行蒸馏，进而用0.005 mol·L-1的硫酸滴定。按公式(1)(2)根据滴定所用硫酸量计算蛋白质含量。每个样品重复3次。

(1)

液体样品中蛋白含量[mg·(100 mg)-1]=
(A-B)×0.14×6.25×N

(2)

式中：A为滴定样品所用稀硫酸的体积(mL)；B为滴定空白样品所用稀硫酸的体积(mL)；N为样品的稀释倍数；C为粉末样品的质量(g)。

2.1.2水分含量测定 采用烘干法[12]103：称取(2.00±0.01) g样品平铺于干燥至恒质量的称量瓶(质量记为m0)中，精确称量其质量记为m1，开口放置于105 ℃的烘箱内5 h，取出冷却后称质量记为m2，再次放入烘箱中重复上述步骤，直至连续2次称量的质量相差不超过0.005 g。每个样品重复3次。

(3)

2.1.3灰分含量测定 采用马弗炉法[12]105：精确称取样品平铺于干燥坩埚(质量m0)中，精确称量其质量m1，置于马弗炉内，500～600 ℃使样品完全炭化，取出冷却，称量其质量m2，再次放入马弗炉内至恒质量。

(4)

2.1.4粗脂肪含量测定 采用索式提取法[13]：精确称取样品放置于干燥滤纸筒(质量记为m0)内，称质量(记为m1)后放入索氏提取器内，石油醚回流8～10 h，烘干称质量(记为m2)。每个样品平行3份，根据所得数据计算粗脂肪含量。

(5)

2.1.5淀粉含量测定 采用旋光法[14]：精确称取3份样品，分多次加入2.1 mL稀盐酸(0.309 mol·L-1)，沸水浴加热15 min，冷却后，依次加入亚铁氰化钾和醋酸锌溶液，摇匀后定容过滤，测定溶液旋光值α1。另称取3份样品，加入40%的乙醇室温放置1 h，定容后过滤，取50 mL滤液加稀盐酸(7.7 mol·L-1)，再依次加入亚铁氯化钾和醋酸锌溶液，摇匀后定容过滤，测定溶液旋光值α2。样品淀粉含量见公式(6)。

(6)

2.2 鸦胆子球蛋白提取

鸦胆子球蛋白提取方法参考文献[15]等。药材用双蒸水4 ℃振荡1 h，4 ℃ 10 000 r·min-1离心(离心半径5为 cm)30 min，弃上清液，重复操作1次；再加入5% NaCl溶液于4 ℃振荡1 h，10 000 r·min-1离心30 min获得鸦胆子球蛋白提取液，重复操作1次，合并2次提取液；球蛋白提取液经布氏漏斗过滤后，4 ℃透析(MWCO=3 kDa)24 h，期间每4 h换1次水，蛋白溶液冷冻干燥后备用。

2.3 SDS-PAGE电泳

采用垂直不连续体系[16]：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。蛋白样品溶液加入适量上样缓冲液后，沸水浴变性5 min，冰浴10 min，上样量为20 μg，室温恒压电泳；考马斯亮蓝R-250染色。

2.4 鸦胆子小分子肽(≤3 kDa)的制备

参考文献[17]将4个产地的鸦胆子球蛋白分别用胃蛋白酶进行水解(底物浓度1%，酶与底物浓度比1∶10，酶解液pH=2.0，37 ℃)，酶解48 h后，100 ℃水浴5 min以终止反应，随即冰浴10 min，于4 ℃，10 000 r·min-1、离心(离心半径为5 cm)20 min，取上清液并转移至超滤管(MWCO=3 kDa)中，4000 r·min-1、4 ℃下超滤离心，收集滤过液冷冻干燥。

2.5 鸦胆子小分子肽对A375的增殖抑制作用

取对数生长期的人源恶性黑色素瘤细胞A375，经胰酶消化后，使其成均匀单细胞悬浮态，调整细胞密度为2×104个mL，按100 μL孔接种于96孔细胞培养板，放置于CO2培养箱中培养24 h后弃去旧培养基，给药组分别加入150 μL受试样品(质量浓度为1、2、4、8、16 μg·mL-1)，阴性对照组加入完全培养基。培养72 h后弃去培养基，加入100 μL MTT，培养箱中孵育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)，于570 nm处测定吸光值(A)，计算细胞增殖抑制率。

(7)

2.6 数据分析

3 结果

3.1 不同产地鸦胆子主成分含量比较

4个产地鸦胆子主成分含量如表2所示。各产地鸦胆子蛋白质含量存在显著差异，广西产地质量分数最高，为17.23%；其次是云南产地，为14.20%；福建和广东产地鸦胆子蛋白质量分数分别为13.20%和12.61%。粗脂肪质量分数中，广西产地最高，为22.10%，广东产地质量分数最低，仅占14.88%。淀粉质量分数中，广西产地最低，为46.73%，广东产地最高，为56.41%。水分均不超过10%，总灰分均不超过6.5%，均符合《中华人民共和国药典》规定。

3.2 不同产地鸦胆子球蛋白含量比较

不同产地鸦胆子球蛋白含量及纯度结果见表3。广西产地鸦胆子质量分数最高，为1.12 mg·(100 mg)-1，占总蛋白的6.52%，显著高于其他3个产地鸦胆子(P<0.05)。同时，广西鸦胆子球蛋白纯度最高，为96.58%，其次是广东、福建和云南，蛋白纯度依次为94.56%、90.21%和87.03%，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同产地鸦胆子检查项目比较 %

注：同一列不同字母表示差异有统计学意义(P<0.05)；下同。

表3 不同产地鸦胆子球蛋白含量

3.3 不同产地鸦胆子球蛋白分子量分布

不同产地鸦胆子球蛋白电泳图谱如图1所示。产地对鸦胆子球蛋白条带分布未造成明显影响，主要分布在33、19、11 kDa附近，但不同产地蛋白条带丰度略有不同。

注：1.标准蛋白；2.广东产地；3.广西产地；4.云南产地；5.福建产地。图1 不同产地鸦胆子球蛋白电泳图

3.4 不同产地鸦胆子小分子肽细胞毒性研究

不同产地的鸦胆子小分子肽作用于A375细胞，均呈现出一定的增殖抑制作用，且随着作用时间的延长细胞数目逐渐减少，细胞均呈现出皱缩变圆、细胞膜破裂、细胞碎片增加的现象(见图2)，而阴性对照组细胞数目随时间呈现正常增长趋势。

注：A.阴性对照组；B.广西产地鸦胆子球蛋白小分子肽给药组；1.给药后24 h；2.给药后48 h；3.给药后72 h；各组给药质量浓度均为8 μg·mL-1。图2 鸦胆子球蛋白小分子肽作用于A375细胞的形态学观察

不同产地鸦胆子球蛋白源小分子肽对人源恶性黑色素瘤A375细胞的增殖抑制率见图3。结果表明，鸦胆子生物肽对A375细胞均呈现一定的增殖抑制作用，且呈时间依赖性和剂量依赖性。以广西产地鸦胆子生物肽为例，当药物质量浓度为4 μg·mL-1时，给药24、48、72 h后，药物对A375细胞的抑制率分别为19.29%、26.14%、41.01%，呈时间依赖性；当药物作用时间为48 h时，随着药物浓度的增加，对A375细胞的抑制率分别为3.96%、8.48%、26.14%、48.98%、68.07%，呈递增趋势。

4产地小分子肽作用细胞72 h后，计算其最小半数抑制浓度(IC50)值，由表4可知，福建产地的IC50值最低，为2.78 μg·mL-1(P<0.05)，其次是广西产地(5.54 μg·mL-1)，云南和广东产地的IC50值较高，分别为8.34、8.16 μg·mL-1，说明福建和广西产地的鸦胆子球蛋白酶解物对人源恶性黑色素瘤细胞A375的细胞毒性较其他2个产地强。

图3 不同产地质量浓度鸦胆子球蛋白小分子肽对A375细胞的增殖抑制率

表4 不同产地鸦胆子球蛋白小分子肽对A375细胞的半数抑制浓度(IC50)

4 讨论

黑色素瘤具有恶性程度高、转移早且广泛等特点，目前该病临床常用的药物治疗方法主要有干扰素、分子靶向和免疫治疗等，但均存在一定缺陷，如易产生耐药性[18]、延迟反应等，且获益者有限[19]。因此，寻找新型高效低毒抗黑色素瘤药物亟待解决。

生物肽是由少于100个的氨基酸通过肽键连接形成的、相对分子质量低于10 000、对生命活动有益或具有一定生理活性的化合物[20]，可以通过酶解法、发酵法和化学合成法等来制备。目前已从多种动植物中获得抗肿瘤肽。Kannan等[21]从米糠中分离得到五肽Glu-Gln-Arg-Pro-Arg具有抑制结肠癌、乳腺癌、肺癌和肝癌细胞生长的作用。Wang等[22]从油菜籽制备得到的多肽Trp-Thr-Pro可引起HepG2细胞凋亡。Wang等[23]酶解牡蛎得到的多肽组分对S180荷瘤小鼠的抑瘤率可达48%。Su等[24]等从山羊脾脏中分离得到的抗癌活性肽(ACBP)通过阻滞细胞周期和细胞凋亡信号通路抑制人胃癌细胞(BGC-823)生长。

产地对有效成分含量及药效有着重要影响。孙向阳等[25]研究表明，不同产地黄芪的解热抗炎作用存在差异；刘英等[26]研究表明云南不同产地人参皂苷总含量差异较大；罗宇东等[27]比较了广西不同产地的滕苦参强心苷含量，发现钦州八塞沟产地含量最高；卢聪[28]等研究结果表明不同产地人参蛋白表达具有显著性差异，且与产地纬度相关。中药材中大分子的药效及物质基础逐渐引起科研工作者重视。本研究对不同产地鸦胆子蛋白质含量和小分子肽细胞毒活性进行了深入研究，结果显示广西产地鸦胆子总蛋白和球蛋白含量最高；且其小分子肽对人源恶性黑色素瘤细胞A375的增殖抑制作用仅次于福建产地，从而为该药的质量标准制定和临床应用提供进一步理论依据，也为恶性黑色素瘤药物的研发提供了新的候选材料。