成纤维细胞生长因子受体2 过表达具有促进细胞增殖的作用

王泽鑫，张佳欣，闫方泰，张宁，王绍清

齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江齐齐哈尔 161000

成纤维细胞生长因子受体 （fibroblast growth factor receptor，FGFR）在多种细胞中广泛表达，结合成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）参与调节细胞增殖，分化和生长等重要的生理过程。 在肿瘤的发生发展过程中，多种癌细胞中FGFR 信号通路发生异常改变，包括基因的突变，扩增，基因重排或异位和基因融合等[1]。

肝内胆管细胞癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是来源于肝内胆管上皮的恶性肿瘤，其发病率有增加的趋势。 吉西他滨加顺铂是目前晚期ICC 治疗的标准非治愈性化疗方案， 目前缺乏有效的二线化疗方案。现阶段通过高通量分子生物学方法已经鉴定出ICC中一些有效的基因治疗靶点，如临床上FGFR 基因异常表达的ICC 患者可能受益于FGFR 靶向治疗[2]。 这些研究结果提示FGFR 信号通路在ICC 的发生发展中发挥重要的作用。 该研采用FuGENE HD 介导的FGFR2 质粒瞬时转染Hucct1 和HEK293T 细胞，观察其在细胞水平对细胞增殖能力的影响， 为进一步研究FGFR2 信号通路在ICC 靶向治疗中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM 培养基（ThermoFisher-11885，美国），胎牛血清（Gibco-16140071,美国），pcDNA3.1-TOPO-FGFR2（GenBank：FGFR2IIIb M97193.1） 质粒由该课题组构建并保存。鼠单克隆Bek 单克隆抗体（SC-6930，美国）、鼠抗 Actin（sc-8432,美国）、羊抗鼠 IgG 二抗（Invitrogen-35513，美国）、FuGENE HD Transfection Reagent（罗氏E2311， 美国），OptiMEM 低血清培养基 （Invitrogen-31985070，美国），特超敏ECL 化学发光试剂盒（碧云天P0018AS，中国），CCK8 细胞增殖检测试剂盒（碧云天-C0037,中国）。 其它化学试剂均为国产分析纯及进口分装。 主要仪器包括 CO2 细胞培养箱 （Thermo -8000，美国）、 YJ1452 型超净工作台（苏州净化设备厂，中国），紫外可见分光光度计（UV1902PC，中国）等。

1.2 质粒瞬时转染

质粒转染参照说书进行，简述如下。 细胞转染前1 d 以 4×105/mL 的密度接种于 6 孔板中，加入 2 mL 不含抗生素、含血清培养基，待Hucct1 和HEK293T 细胞融合达到85%融合时进行质粒转染。FuGENE 转染试剂与OptiMEM 培养基混合孵育5 min 后再加入适量质粒（FuGENE HD：质粒=3：1）混合孵育 15 min。 每 6 孔板加入适量混合液。 细胞继续培养48 h 后收集细胞进行后续实验。

1.3 Western Blot 检测蛋白表达

质粒转染48 h 后， 提取细胞总蛋白并定量。 进行12% SDS-PAGE 电泳，然后将蛋白转移至PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭2 h。 转印后PVDF 膜依次与一抗 （1：1 000）,二抗（1：5 000）进行免疫印迹反应后进行 ECL 发光,蛋白条带表达通过Image J 软件进行分析。实验重复3 次。

1.4 CCK8 检测细胞增殖

CCK8 检测细胞增殖按说明书进行，分别在转染后12 h，24 h 和 48 h 检测 450 nm 波长的 OD 值。 细胞以1×104个/100 mL 加入 96 孔板中，每孔加入 10 μLCCK8溶液，加入细胞培养液和CCK8 溶液的无细胞孔为空白对照组。 细胞放入在培养箱中继续培养1 h 后，使用酶标仪在450 nm 进行检测OD 值。每个样本设5 个副孔。实验重复3 次。

1.5 统计方法

应用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，进行t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染 pcDNA3.1-TOPO-FGFR2 质粒细胞内FGFR2 蛋白表达增加

质粒转染后48 h 后，Western Blot 检测结果显示：与未做处理的Hucct1 细胞相比， 转染组Hucct1 细胞FGFR2 蛋白的表达量明显增加,差异有统计学意义（P＜0.01）。 与未做处理 HEK293T 细胞相比， 转染组HEK293T 细胞内FGFR2 蛋白的表达量也明显增加,差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 各组细胞FGFR2 蛋白表达水平(±s)

表1 各组细胞FGFR2 蛋白表达水平(±s)

注：1 vs 2, P=0.006； 3 vs 4, P=0.001

组数 细胞类型 FGFR2 蛋白表达1 2 3 4 Hucct1 对照组Hucct1 转染组HEK 293T 对照组HEK 293T 转染组0.214±0.039 0.411±0.009 0.195±0.026 0.447±0.032

2.2 FGFR2 过表达促进细胞增殖能力

在转染 FGFR2 质粒后 12 h，24 h，48 h 后检测各组细胞增殖能力。 结果显示，在转染后48 h，HEK293T 对照组 450 nm OD 值为（0.413±0.008）, 转染后 HEK293T OD 值为 （0.676±0.033）（t=7.699，P＜0.000）； 对照组Hucct1 OD 值 （0.527± 0.015）, 转染后 Hucct1 细胞 OD值（0.769±0.035）（t=6.205，P＜0.000）。结果提示，在细胞内过表达FGFR2 基因具有促进非肿瘤细胞及肿瘤细胞增殖的能力。

3 讨论

FGFR 是一种跨膜酪氨酸激酶受体，在不同的细胞中参与细胞分化、生长、迁移、伤口愈合和血管生成等生物学过程。 该家族包括FGFR1,FGFR2,FGFR3HE FGFR4 四种。 已有研究证实FGFR 受体家族胞外区2个或3 个免疫球蛋白（Ig）样结构域可与多种FGF 配体结合并相互作用， 逐级催化酪氨酸激酶催化结构域和具有多个酪氨酸磷酸化的羧基末端结构域位点， 激活多条下游信号通路而发挥作用[3]。 在人类，由于FGFR2 基因 mRNA 选择性剪切，FGFR2 基因有 FGFR2IIIb 和FGFR2IIIc 两种亚型，FGFR2IIIb 主要表达于上皮细胞，FGFR2IIIc 主要表达于间质细胞中。 通过基因测序鉴定出 ICC 中 FGFR2 基因亚型为 FGFR2IIIb 型[4]，该次研究选择以人FGFR2IIIb mRNA 目标基因构建的pcD NA3.1-TOPO-FGFR2 表达质粒为研究对象，在细胞水平上研究FGFR2 基因对胆管癌细胞生物学功能的影响。

在许多研究报道中，FGFR2 家族是原癌家族成员之一，具有促进肿瘤生长的作用，如乳腺癌中FGFR2 阳性率为68.67%(57/83）， 高于正常对照组; 而且FGFR2的高表达与肿瘤的进展和临床分期密切相关（P＜0.05）；Guy 报道，2%胃癌组织中存在FGFR2 基因扩增， 并且FGFR2 基因的扩增与患者不良预密切相关， 以上结果提示FGFR2 基因的扩增是肿瘤的发生发展过程中的关键节点[5-6]。 最近研究中报道FGFR2 基因的异常表达，如基因突变（p.N549H, p.N549K, p.V564F, p.E565A and p.K659M)、基因扩增、融合（如 FGFR2-ACSL5 融合）与肝内胆管细胞癌的发生发展关系密切， 可能是一个新的基因治疗靶点[4,7-10]。Ding 等[4]在动物实验研究中发现，FGFR2 基因融合具有促进裸鼠胆管癌病人来源异种移植肿瘤的生长[68 d 肿瘤体积(1 210±127.9)mm3]，应用小分子酪氨酸激酶Dovitinib 抑制剂后， 肿瘤体积较对照组明显缩小[68 d 肿瘤体积(269.7±24.98）]，并且治疗组肿瘤组织内FGFR2 蛋白及其下游AKT 蛋白的表达较对照组表达下降（P＜0.01）,说明 FGFR2 信号通路与ICC 的发生发展有关[4]。

Rizvi S 等[7]研究发现 YAP 基因通过激活 FGFR2 基因促进Hucct-1 细胞的增殖，Md Wahiduzzaman[11]等研究通过基因敲除人间皮瘤细胞系 NCI-H2052 细胞FGFR2 基因的表达抑制了该细胞的增殖能力， 以上研究结果显示FGFR 具有促进肿瘤细胞增殖的能力。该研究得出相似的结果， 在胆管癌细胞中过表达FGFR2 具有促进细胞增殖的作用。 在人胆管癌Hucct1 细胞和HEK293T 细胞中过表达FGFR2IIIb 基因后， 观察其对细胞生物学行为的影响。 瞬时转染FGFR2 基因后，FGFR2 蛋白在 Hucct1 细胞 [（0.411±0.009）vs （0.214±0.039）] 和 HEK293T 细胞 [（0.447±0.032）vs （0.195±0.026）]中表达明显增加，说明pcDNA3.1-TOPO-FGFR2在细胞内转染成功。在细胞内过表达FGFR2 基因后，通过CCK8 检测细胞增殖能力的变化， 研究结果显示HEK293T 和 Hucct1 在转染后 48 h 细胞增殖能力[（0.676±0.033），（0.769±0.035）]较未做处理的对照组相比[（0.413±0.008）,（0.527±0.015）]，在 450 nm OD 值明显增加， 说明FGFR2 基因表达具有促进胆管癌细胞增殖的作用。 该次的研究在细胞水平验证FGFR2 基因的过表达具有促进细胞生长的作用， 说明FGFR2 基因的过表达与ICC 发展有密切关系， 而且其发挥作用的机制可能与FGFR2 信号通路的激活有关。

综上所述，FGFR2 基因的过表达具有促进正常细胞和人胆管癌细胞增殖的作用， 但其具体作用机制还需进一步的研究。 该次研究结果为FGFR2 基因在ICC发挥作用及作用机制的研究奠定了一定的基础。