康艾注射液中间产品人参提取液中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量测定方法及高效液相指纹图谱研究

2020-03-27李建英李晓彤王道新纪丽岩祁宇祥米广明

人参研究 2020年1期

李建英，李晓彤，翁红，王道新，纪丽岩，祁宇祥，王波，米广明

（1.长白山制药股份有限公司，吉林132500；1.延边大学，延边133002）

康艾注射液具有益气扶正，增强机体免疫功能。用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、妇科恶性肿瘤等疾病。康艾注射液主要原料之一人参药用历史悠久，古有“补药之长”之称，为历代中医最常用的中药之一。人参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey）干燥的根。据《神农本草经》记载，人参具有“主补五脏，安精神，止惊悸，除邪气，明目，开心益智”的功效。其在中医药临床领域，具有悠久的历史，随着现代科技的飞速发展，对人参的研究也得到进一步的发展。人参作为单方或复方中的重要组成之一，已经被开发成很多中成药[1～4]，其中也包括注射剂。人参皂苷Re和Rg1是人参药材中的重要有效成分，其含量测定方法和指纹图谱分析[5～8]有很多文献报道。但目前对于中药制剂中间体的质量控制研究相对较少。作为含人参中药复方制剂中间体的中人参皂苷Re和Rg1的质量控制研究也尤为重要，其含量会影响中药制剂最终产品的质量。因此，本文采用高效液相法首次测定作为康艾制剂中间体的不同批次人参提取液中人参皂苷Re和Rg1的含量和指纹图谱，为中药制剂生产的全程质量监控提供重要的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent 1200 VWD检测器；Agilent 1200 ALS自动进样器；Agilent 1200 Bin pump；Agilent Chemstation 色谱工作站）；METTLER AG245十万分之一天平。

1.2 试药

人参皂苷Re对照品（批号：110754-200822；纯度：88.8%；中国药品生物制品检定所）；人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201530；纯度：91.7%；中国药品生物制品检定所）；实验中所用乙腈、甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。

人参提取液样品由长白山制药股份有限公司提供。

2 色谱条件

色谱柱：岛津 VP-ODS（4.6 50 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（20：80）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：203 nm。

3 实验方法与结果

3.1 供试溶液的制备

3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷 Re、Rg1对照品 4.60 mg、4.50 mg，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含人参皂苷Re和人参皂苷Rg1分别为0.0408 mg和0.0413 mg的对照品混合溶液。

3.1.2 供试品溶液的制备

取样品溶液0.2 mL，加80%甲醇定容至50 mL容量瓶中，摇匀，分析前用微孔滤膜（0.22μm）滤过，滤液作为供试品溶液。

3.2 系统适应性实验

取3.1.2项下供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪测试。对照品及样品色谱图分别见附图1、2。

3.3 标准曲线及线性范围实验

精密吸取上述配制好的对照品混合溶液0.5、1、5、10、15、16μL依次注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下分别测定其中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的峰面积(A)，以峰面积为纵坐标，以对照品的量（mg）为横坐标，分别绘制标准曲线，得出回归方程分别为：人参皂苷 Rg1：Y=372.73X-0.7504，r=0.9998；人参皂苷 Re：Y=309.42X+1.4858，r=0.9992。人参皂苷 Rg1和人参皂苷 Re分别在 0.0207～0.6608 μg，0.0204～0.6120μg范围内呈良好线性关系。

3.4 精密度实验

分别精密吸取人参皂苷Rg1、Re对照品溶液各5 μL，重复进样6次，测定峰面积，结果见表1。

表1 精密度实验

结果表明：仪器精密良好。

3.5 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液 5μL，于0，2，4，6，8，10 h 注入高效液相色谱仪，分别测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的峰面积，其相对标准偏差RSD%分别为1.20%和1.70%，结果表明：样品中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在10 h内均稳定。

3.6 重复性实验

取同一批次样品，按3.1.2项下制备方法，分别制备6份供试品溶液，各取5μL注入高效液相色谱仪分别测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量，其相对标准偏差RSD分别为2.75%和2.39%。结果表明本方法的重复性良好。

3.7 加样回收率实验

分别取已知含量的同一供试品溶液6份，精密称定，分别加入一定量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re对照品，分别取5μL注入高效液相色谱仪测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率实验

3.8 样品测定

分别精密吸取3.1.2项下制备好的供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，分别计算各样品中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量，结果见表3。

表3 人参提取液中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量

结果：各批中样品中的人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量分别为 6.48～9.17 mg/ml和 7.40～9.55 mg/ml。

3.9 指纹图谱的建立与分析

共有峰的标定：通过对8批样品分析，将色谱图5～60 min内的7个色谱峰定为共有峰（见附图3），其中，特征峰1相对峰高较高，分离度较好，保留时间也比较稳定，因此，选择这个特征峰作为指纹图谱的参照物色谱峰，通过与标准物质比较，确定其为Rb1，结果见附图4。

3.9.1 相似度分析

8批样品的HPLC色谱图，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2012 A版)进行分析，计算出人参提取液指纹图谱的相似度。8批人参提取液的色谱指纹图谱见附图5，以8批样品均值生成的共有模式为对照，计算各批样品的相似度，结果见表4。

表4 8批人参提取液指纹图谱相似度结果

4 讨论

4.1 由于人参提取液浓度较大，根据相关工艺情况，本实验分别考察了80%甲醇、75%乙醇、水3种不同溶剂作为稀释溶剂的供试品溶液的方法，结果表明，用80%甲醇稀释人参提取液获得的供试品溶液的HPLC色谱峰形较好，提取效率较高，分离度较好，有利于人参提取液的含量测定。通过加样回收率实验进行准确度考察，最终确定上述供试品溶液制备方案。

4.2 本实验进行了色谱柱考察。考察的色谱柱包括：Intersil ODS-3(4.6 150 nm 5μm）柱、ZoRBA SB-C18(4.6 250mm 5 μm）柱、岛津 VP-ODSC18（4.6 50 mm，5μm）柱。结果表明，岛津VP-ODSC18色谱柱分离度较好。