苦参碱对人喉癌Hep-2细胞生长和凋亡的影响

刘 敩，王 晶，张 辉，方宏艳

(吉林大学第二医院，吉林 长春130041)

显著性地区差异是喉癌的流行病学特征,我国东北地区为喉癌高发区，并且呈逐年升高趋势[1]。目前喉癌治疗主要以手术治疗为主，同时辅以化疗放疗，内分泌治疗等。研究发现，天然植物中的生物碱具有明显的抗肿瘤功效[2]。目前已经发现的抗肿瘤生物碱包括小檗碱、长春新碱、喜树碱、苦参碱、紫杉醇等生物碱，本研究以人喉癌细胞株(Hep-2细胞)为靶系统体外观察苦参碱对Hep-2细胞增殖周期及诱导凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料人喉癌细胞株由吉林省肿瘤研究所馈赠。RPMI1640培养基，四甲基偶氮唑蓝(MTT试剂)购自美国sigma公司，苦参生物碱注射液购自上海伊帮医药信息有限公司。

1.2 方法MTT比色法检测Hep-2细胞增殖抑制率，流式细胞术检测Hep-2细胞周期进程变化，参照文献[3]进行。苦参碱诱导Hep-2细胞凋亡率检测采用吖啶橙吸收法。

2 结果

2.1不同浓度苦参碱对Hep-2细胞增殖抑制率具有一定的剂量依赖性，组间比较差异显著，见表1。

表1 不同浓度苦参碱制剂对Hep-2细胞增殖抑制率

2.2不同浓度苦参碱制剂对Hep-2细胞周期进程影响，可见G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，组间比较差异有统计学意义，见表2。

表2 不同浓度苦参碱制剂对Hep-2细胞周期进程影响

2.3 荧光染色结果不同浓度苦参碱制剂对Hep-2细胞均有促凋亡作用，4 mg/ml、8 mg/ml苦参碱制剂作用于Hep-2细胞凋亡率升高分别为(29.4±4.3)%和(42.8±4.7)%，见图1-3。

图1 0 mg/ml 苦参碱诱导Hep-2细胞荧光染色图400× 图2 4 mg/ml 苦参碱诱导Hep-2细胞荧光染色图100× 图3 8 mg/ml 苦参碱诱导Hep-2细胞荧光染色图100×

3 讨论

苦参碱作为中药苦参的萃取物，临床上用于杀虫、抗炎、抗过敏等常用药。近年来研究表明，苦参碱具有抗肿瘤、抗新生血管生成等特殊作用。体外实验证明，苦参碱对肝癌、胃癌、肺癌等肿瘤细胞均有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用[3]，且对正常细胞无影响。本研究以Hep-2细胞为靶点。观察不同浓度苦参碱对其生物学作用机制，结果表明，MTT法检测不同浓度苦参碱制剂对Hep-2细胞的增殖抑制率，0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml组分别为2.1%、18.1%、26.3%和44.9%，与对照组相比差异有统计学意义，且苦参碱对人Hep-2细胞的增殖抑制作用具有一定的剂量依赖性。

流式细胞术结果显示，不同浓度的苦参碱制剂作用Hep-2细胞24小时后均能显著提高G0/G1期细胞比例。而S期细胞比例减少，从而使G2/M期细胞相对增多，细胞周期间比例失衡。G0/G1期细胞阻滞不能顺利进入S期，故S期细胞减少。同时G0/G1期细胞也是各种化疗药物作用的敏感点[4]，G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应，G2/M期也是细胞进入有丝分裂前最后一道关卡[5]，临床上多种治疗手段都会使肿瘤细胞具有选择性的停滞于该期。此外，本研究应用免疫荧光技术，对不同浓度的苦参碱制剂诱导Hep-2细胞凋亡机制的探讨，结果表明，BB(溴化乙啶)为啡啶类染料可嵌入多核苷酸结构，活细胞膜可排斥BB穿透，而凋亡细胞和死亡细胞极易穿透，故凋亡细胞被染成黄色。死亡细胞则呈均匀红色，而AO(吖啶橙)，可穿透活细胞膜，细胞被染成绿色，通过荧光显微镜极易区别。

综上所述，苦参生物碱抗肿瘤机制与干扰肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管生成和多药耐药等有关。