血清MicroRNA 122和MicroRNA-130a水平在隐匿性乙型肝炎病毒感染中的诊断价值初探

徐兰锋， 王 倩， 刘洪玲， 迟男男

(1.辽宁省锦州市中心医院, 辽 宁 锦 州 121001 2.佳木斯大学附属第一医院消化二科， 黑龙江 佳木斯 154003)

乙型肝炎病毒(HBV)是一种传染性疾病，感染人群中约25%的人可发展为慢性乙型肝炎患者，并可能进一步发展成为肝硬化、肝癌等疾病，严重危害人们生命健康[1]。隐匿性乙型肝炎(OBI)是HBV感染的一种特殊状态，一般是指血清学检测HBsAg阴性，但血清或肝脏组织中HBV呈阳性，其滴度一般在200 IU/mL以下[2]。作为HBV感染传播的潜在威胁，是乙肝预控的一大障碍，有着重要公共卫生意义。研究表明[3]，OBI与慢性肝病发生、进展紧密关联，是爆发性肝炎的重要危险因素。近年来，微小核糖核酸(microRNA)在乙肝产生、演变进程中的作用日益引起关注。研究证据表明，microRNA能够对HBV复制及人体免疫力产生影响，从而参与乙肝病程发展机制。如有研究发现[4]，miR-122在肝癌细胞中过度表达能够抑制肝癌进展。还有研究指出[5]，miR-130a可以调控介导HBV相关雌激素α受体表达从而对HBV的复制产生抑制作用。本研究旨在研究血清miR-122、miR-130a和OBI关联性，及其作为新的循环标志物诊断OBI的临床价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1临床资料:选取2018年6月至2019年6月我院收治的慢性乙型肝炎(CHB)患者60例(CHB组)、非活动性HBsAg携带患者(ASC)60例(ASC组)及OBI患者60例(OBI组)；CHB组：男35例，女25例，年龄(53.78±10.22)岁；ASC组：男38例，女22例，年龄(53.78±10.68)岁；OBI组：男40例，女20例，年龄(51.87±9.65)岁。纳入标准：①CHB、ASC、OBI都满足《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]的诊断标准；②愿意接受相关检查。排除标准：①同时伴其他类型肝炎病毒或其他肝损害者；②人类免疫缺陷病毒感染者；③伴严重心脑肾疾病者；④存在酗酒史者；⑤有结核病史或血吸虫病史者。另收集可疑患者60例(对照组)，均排除肝病、传染病史及免疫疾病等，其中男36例，女24例，年龄(52.45±9.78)岁。各组性别、年龄等比较无统计学差异(P>0.05)。

1.2方 法

1.2.1标本采集：所有对象均采集清晨肘静脉血6mL，离心(6070r/min)8min，取上清液，装于离心管中，再次离心(1.3×104r/min)8min，取上清液，置-80℃环境下储存备用。

1.2.2总RNA的提取：取血清200μL，以miRcute血清/血浆miRNA提取试剂盒进行总RNA提取，严格按试剂盒说明书进行操作。无菌条件下，采用NanoDrop200超微量分光光度计进行RNA浓度及纯度测定。当A260/A280值在1.80～2.00范围内，即可认为所提取的RNA纯度合格。

1.2.3血清miR-122、miR-130a检测方法：采用荧光定量PCR法，以两步法检测miR-122、miR-130a，按美国Applied Biosystems公司TaqMan-microRNA逆转录试剂盒说明进行反转录反应。荧光定量PCR，应用通用的反转录条件转录目的miRNAs，95℃ 30s、95℃ 10s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，40次循环，以cel-miR-39作为内参，参照公式计算miR-122、miR-130a的相对表达量。

2 结 果

2.1比较四组患者的miR-122、miR-130a含量：各组血清miR-122、miR-130a相对含量比较有统计学差异(P <0.05)。OBI组miR-122相对含量明显低于对照组、ASC组、CHB组(均P<0.05)，miR-130a相对含量明显高于对照组、ASC组、CHB组(均P<0.05)；且miR-122相对含量在OBI组、对照组、ASC组、CHB组间依次增高(均P<0.05)，miR-130a相对含量在OBI组、CHB组、ASC组、对照组间依次降低(均P<0.05)。见表1。Pearson相关性研究显示，OBI组miR-122与miR-130a呈负相关(r=0.421，P<0.05)。

表1 四组患者miR-122 miR-130a含量比较

2.2各组miR-130a/miR-122值比较：为进一步探讨OBI患者miR-122、miR-130a表达情况，对两者比值进行统计分析，结果显示，miR-130a/miR-122值在OBI组为(2.13±0.64)，对照组为(0.76±0.25)，ASC组为(0.72±0.23)，CHB组为(0.70±0.22)，各组间比较有统计学差异(F=29.582，P<0.05)。两两比较显示，OBI组miR-130a/miR-122值明显高于ASC组、对照组及CHB组(均P<0.05)，而ASC组、对照组、CHB组之间两两比较均无统计学差异(均P>0.05)。

2.3血清miR-122、miR-130a及其比值在OBI中诊断分析：ROC曲线表示，血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与可疑患者曲线下面积为0.859(95%CI：0.762～0.955)、0.844(95%CI：0.739～0.950)、0.945(95%CI：0.018～0.989)，最优截断值分别为1.68、2.74、0.89，敏感度和特异度分别为80.2%和78.6%、87.6%和73.5%、92.1%和95.3%。 miR-130a/miR-122曲线下面积最大，因此miR-130a/miR-122在区分OBI与可疑患者的诊断价值更高。血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与ASC曲线下面积分别为0.942(95%CI：0.021～0.995)、0.813(95%CI：0.699～0.927)、0.964(95%CI：0.012～0.997)，最优截断值分别为1.74、2.68、0.84，敏感度和特异度分别为89.2%和86.7%、75.4%和80.3%、90.2%和93.6%。miR-130a/miR-122曲线下面积最大，因此miR-130a/miR-122在区分OBI与ASC的诊断价值更高。血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与CHB曲线下面积分别为0.998(95%CI：0.000～1.000)、0.646(95%CI：0.503～0.789)、0.993(95%CI：0.000～1.000)，最优截断值分别，敏感度和特异度分别为95.2%和100.0%、72.3%和59.8%、96.4%和97.1%。miR-130a/miR-122曲线下面积最大，因此miR-130a/miR-122在区分OBI与CHB的诊断价值更高。

图1 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与可疑患者ROC曲线

图2 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与ASC的ROC曲线

图3 血清miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值区分OBI与CHB的ROC曲线

3 讨 论

microRNA是一类真核生物内源性非编码单链的小RNA分子，长约19～23个核苷酸，研究表明[6]，尽管microRNA在人体基因数中仅占2%，却对30%以上人体基因的表达有着调控作用，参与了细胞增殖、凋亡等多种生物学行为，与多种疾病发生、进展紧密关联。近年来，microRNA成为慢性肝病诊断及治疗的研究热点。microRNA能够影响HBV复制，调控机体免疫功能，而对乙肝发生发展产生抑制或促进作用。有研究显示[7]，乙肝患者的血清miR-375、miR-133含量明显高于正常对照组，可作为乙肝肝癌早期诊断的新型循环标志物。虽然目前已有较多microRNA与HBV感染慢性肝病关系方面的文献报道，然而关于OBI患者血清microRNA表达相关报道仍尚少。

miR-122是一种小分子RNA，可以作为人类肝脏特异性表达指标，可调节一系列生物信号网络介导着肝脏细胞的增殖、分化、凋亡及肝脏病变的发生发展过程。有研究发现[8]，采取抗miR-122可抑制其表达，能够引起HBsAg及HBeAg的分泌明显降低。此外，Wang G等[9]研究表明，通过阻止miR-122表达能够诱导HBV感染，引起干扰素失效，进而促进感染肝细胞中HBV复制。本研究显示，OBI组血清miR-122相对表达量明显低于ASC组及CHB组，且血清miR-122相对表达量在OBI组、对照组、ASC组、CHB组间依次增高，同时ROC曲线表示，miR-122可以很好地判断OBI与可疑患者、ASC及CHB患者。认为与HBV感染有关，且和I型干扰素密切关联的抗病毒反应，该机制在OBI的发展中有着重要作用。然而关于miR-122和HBV感染之间具体机制仍需深入探讨。本研究还发现，OBI组miR-130a相对含量明显高于ASC组、对照组及CHB组，且miR-130a相对含量在OBI组、CHB组、ASC组、对照组间依次降低。研究[7]认为，在HBV感染的肝细胞中，miR-130a能够抑制HBV转录及蛋白质合成，从而降低HBV 的复制。研究表明[10]，miR-130a可能通过调控I型干扰素及mxA、ISG15等干扰素刺激基因的表达，从而对丙肝病毒DNA复制起到抑制作用。本研究也发现，OBI患者血清miR-122与miR-130a表达呈负相关，且OBI组miR-130a/miR-122值明显高于对照组、ASC组及CHB组，考虑OBI患者miR-122与miR-130a相关关系及miR-130a/miR-122值增高可能与上述机制相关，但仍需进一步验证。

血清生物标志物的检测有着简便、可重复性好等诸多优点，对疾病诊断有着很高实用性。本研究显示，miR-122、miR-130a及miR-130a/miR-122值在OBI的诊断过程中起到重要作用，能够很好地进行OBI与可疑患者、ASC及CHB区分。Chen y等[11]也曾探讨了miR-122、miR-150OBI的临床检测价值，但其仅作了OBI患者与可疑患者及CHB患者的区分。

综上，本研究发现，miR-122水平降低、miR-130a水平增高和OBI有一定关联，且其作为新的循环标志物，对OBI诊断有重要价值，能够很好地将OBI与可疑患者、ASC及CHB区分开来，值得临床关注。