秀丽隐杆线虫与FUdR在抗衰老研究中的应用

王素娟，赵耀，王晓雪，程翠婷，伊克运，张肖

（河南大学第一附属医院 老年科，河南 开封）

0 引言

随着社会进步，生活水平的提高，人们对于长寿这一问题越来越关注，因此对如何长寿、如何抗衰老的研究也越来越多，比如各种中草药、西药、中药与西药结合、各种保健品等，使其作用于各种生物模型，观察其生命周期的长短，以此来评价药物是否有延长或缩短寿命的疗效，间接判断是否可以引起长寿。

由于小鼠生存周期比较长，一般2-3年，价格比较昂贵，制作模型也比较麻烦， 操作不可控性因素较多，因此一般不用做衰老模型的首选。细胞生物是一种独立于个体之外的实验，对环境要求比较严格，由于独立个体之外，不能完全解释机体内变化。相比于前两者，秀丽隐杆线虫是一种整体的多细胞生物，在其基因组中有42%基因与人类疾病存在相关性[2]，生存周期短，操作简单，是实验中应用最广泛的模型，而且可以通过基因敲除技术得到实验所需要不同基因型的突变体。

1 衰老的介绍

衰老（Senility）的研究最早来自西方，而不是东方，人类对于衰老的认识经历了三个阶段[3]，即神学阶段、形而上学阶段、科学证实阶段。在中医中，衰老有其独特的理论，冀敦福等[4]总结提出以下学说：先天说、后天说、五脏虚阴说、阴阳失调说、气运失常说等。20世纪后期，随着老年医学引入分子、细胞生物学理论与技术，衰老机制研究从整体水平上升到细胞水平[5]。近半个世纪以来，已经提出一系列衰老学说，印大中等[6]总结出衰老学说主要包括：整体水平衰老学说、器官水平学说、细胞水平衰老学说和分子水平衰老学说等。陈文等[7]认为其中最具代表性的衰老学说是“端粒衰老学说”“自由基衰老学说”等。

2 秀丽隐杆线虫的介绍

秀丽隐杆线虫是世界范围内发现的微小的、自由生存的生物[8]，身体基本结构包括：口、咽、肠、性腺、肌肉、神经等结构，通常分为雌雄同体和雄性线虫两种，两者的主要区别在于尾部的形态，雌雄同体的线虫尾部较为细长，雄虫尾部相对较粗且呈钝圆状见（见图1）。其中雌雄同体占99.8%-99.9%，雄性只占0.1-0.2%，这是由于雌雄同体的性腺形成一个卵子睾丸，可以在受精之前暂时产生卵子，每个成虫大约可以产生300个后代，这有利于大量繁殖。科研实验一般都是用的雌雄同体。

图1 雌雄同体秀丽隐杆线虫）

秀丽隐杆线虫发育主要包括胚胎期、幼虫期和成虫期三个过程，其中胚胎期是指从卵孵育到L1期的线虫，L1期线虫体积小，长度大约0.25mm。幼虫期包括L1、L2、L3、L4四个时期，L4期线虫蜕皮之后成为成虫（见图2）。在L2期，如果出现外界环境不适应（温度过高或过低）或食物缺乏，线虫生长就会停止，激活另一个生命周期[9]，进入一种休眠状态，称为“Dader”幼虫。此期线虫个体较L3期瘦小，但它可以长时间保持这种状态，如果外界环境变为正常，此期线虫可以直接跨越L3期而进入L4期，利用这种特征，可以使用低温冷冻技术保存线虫[10]。

图2 不同时期的秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫的结构简单，生命周期短，大约2-3周左右，可以通过基因敲除得到所需目的基因，也就是特定突变体，比如daf-2、daf-16，这就使得它成为实验的良好模型。这不仅与它具有一个强大的遗传系统外，还有其本身的优势，包括：体积小、产卵量大、易于培养、费用低、保存时间长、传代快、透明度高。另一个有利特征是，这种微生物对人体是无害的。正是由于以上几种特点，秀丽隐杆线虫被人们认为是最简单、最高效、便宜的模型。

在1963年，已经在DNA、RNA和遗传密码方面取得成功的Sydney Brenner[11]提出，生物研究的未来在于模型生物，Brenner认为，生物研究需要一个系统，它可以在实验中大量生长，成本低，并有一个简单的计划，他选择秀丽隐杆线虫扮演这一角色，自那以后，秀丽隐杆线虫成为了研究衰老的模型系统之一，目前已有1200多家实验室在用秀丽线虫作为实验模型。秀丽隐杆线虫在神经退行性疾病中应用也比较多，比如阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson，s disease,PD）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等。

3 5-氟-2’-脱氧尿苷（FUdR）的介绍

5-FLUORO-2’-DEOXYURIDINE是5-氟-2’-脱氧尿苷的全称，简称FUdR，分子式：C9H11FN205,分子量：246.1924，纯度99%。FUdR一种高效低毒的抗代谢类细胞周期特异性抗肿瘤药，虽属氟尿嘧啶类，但有其独特的药理作用，主要通过抑制胸腺嘧啶核苷合成酶的活性来发挥作用，从而抑制DNA、RNA合成。正是由于这一点，实验用的FUdR通过抑制DNA合成，从而抑制线虫产卵，保证实验同质性。目前已是秀丽隐杆线虫实验中必不可少的一种药物。

4 （FUdR）与秀丽隐杆线虫在抗衰老中的应用

秀丽隐杆线虫是目前常用且高效的抗衰老模型，由于其从受精卵到发育至成虫过程中存在时间的差异，在光学显微镜下会观察到各个时期（L1-成虫）的线虫，尤其在性成熟之后，线虫会大量繁殖，需要操作者每隔一天或者每天挑出成虫，有时刚成熟的线虫与已经成熟几天的线虫难以区分开来，这给实验很大麻烦，难以保证线虫的同质性。Mitchell等[12]在1979年发现用FUdR处理发育L4的线虫，可以抑制其繁殖和后代的生长，从而保证实验的可行性。

迄今为止，FUdR对寿命的影响不仅仅局限在野生型线虫（N2）中观察[13]，在其他不同突变体的秀丽隐杆线虫也有不同影响。FUdR对野生型N2寿命影响非常不明显，但在GAS-1突变体中可以使线虫寿命延长2倍[14]，可以使tub-1寿命延长8%。在Wang H等[15]实验中发现，FUdR在不同时期处理线虫，对其生存率影响也是不同的。在L4、Day1期用 50μM的FUdR处理，会使寿命显著且轻微缩短3.5%和5.9%；在Day2、Day3期用FUdR处理，寿命增加了8.5%和8.8%，这可能是在早期应用FUdR可以干扰发育，对健康产生有害影响，加速肠道萎缩；而后期主要影响衰老病理方面，延缓寿命缩短。在Kato Y等[16]人实验中发现FUdR可以使Fem-3、EXO-3寿命延长，并指出FUdR对寿命的影响可能包括两方面：一是干扰生育，延长寿命；二是导致DNA碱基损伤，缩短寿命。不同浓度的FUdR对线虫影响也是不完全相同的，低浓度（10-25）FUdR对野生型n2 的lifespan影响不大[17]，较高浓度才会对lifespan有影响。

5 结论与展望

衰老是一种常见现象，如何抗衰老一直是困扰人们的难题？秀丽隐杆线虫是一种结构简单，生命周期短的多细胞生物，目前在抗衰老研究中发挥着举足轻重的作用。虽然目前FUdR在线虫寿命中的机制还不是很明确,实验已经发现FUdR对不同突变体线虫的寿命影响是不同，不同时间点给药对线虫寿命影响也是不同。FUdR对秀丽线虫寿命的影响是延长还是缩短，可能与给药时间点有一定相关性，在早期给药可以导致线虫寿命缩短，在晚期或较后期给药可以延长寿命。未来我们希望可以了解不同品牌来源的FUdR对同一线虫寿命是否有影响？每个实验都要具有可重复性,有的实验很难重复出来，或许可能是每个实验室所选择的FUdR来源不同，是否是这一原因需要我们进一步研究。