微波加热法用于竹叶水提取总黄酮的应用研究

黄 皓

（新平县农产品质量安全检验检测站，云南新平 653400）

目前进行竹叶黄酮类物质的提取方法很多，有微波、超声波辅助有机试剂、回流等常用提取方法。本文采用提取竹叶中的黄酮类量为指标，参考比较三种提取方法，并设计单因素实验研究实验最佳条件，以期筛选出提取黄酮类物质最快、最优、最经济环保的实验方法，为植物样品提取黄酮类物质提供参考。

本试验主要是以去离子水为提取液的微波法浸提竹叶总黄酮，同时进行微波提取单因素条件变量对比研究，总结出提取竹叶总黄酮的最佳工艺。微波法相比较其他提取方法有实验装置简单方便、实验过程简单、提取率较高、时间短、提取剂经济易得、整个实验经济环保等优点。

1 材料与方法

1.1 供试材料

竹叶采自新平县花山大庙百竹林，自然风干备用。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器

ME204E电子天平、高速药物粉碎机、HH-S11电热恒温水浴锅、回流管、蒸馏烧瓶、WD900G型微波炉、801型磁力搅拌器、电炉、500 mL大烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、抽滤机、移液枪、超声池、721型紫外可见分光光度计、超纯水仪、60目筛。

1.2.2 试剂

芦丁、95 % 乙醇、 甲醇、石油醚、NaNO2、AL（NO3）3、NaOH等试剂均为分析纯，去离子水有超纯水仪制备。

1.3 样品预处理

将自然晒干的竹叶洗净并烘干，用高速药物粉碎机粉碎，再经过60目筛，取得竹叶粉备用。

1.4 竹叶总黄酮不同提取方法

1.4.1 微波提取法

准确称取5 g竹叶粉，按固液比1 ∶ 20去离子水，浸泡20 min（期间用磁力搅拌器搅拌5 min），再放入设定好功率和时间的微波炉中进行辐射后，经抽滤机抽滤过滤，滤液移置250 mL容量瓶，用去离子水定容刻度并摇匀，取样分析化验（用3倍的石油醚萃取3次取下层溶液，下层溶液进行定量分析测定）。

1.4.2 超声提取法

准确称取5 g 竹叶粉，放入50 mL比色管中，将比色管放入1000 mL大烧杯中加入一定量水，放入超声池中，按料液比1 ∶ 30（如碎竹叶取1 g，则所用甲醇溶液为30 mL）浓度为60 %的甲醇溶液进行提取。提取时间为1 h，超声池频率为53 Hz，超声后得到提取液和残质进行减压抽滤，滤液取样分析化验（用3倍的石油醚萃取3次取下层溶液，下层溶液进行定量分析测定）。

1.4.3 回流提取法

准确称取5 g竹叶粉,置于100 mL烧瓶中,以料液比为1 ∶ 20的60 %甲醇液回流提取1 h，经过滤取其滤液进行萃取（用3倍的石油醚萃取3次取下层溶液）浓缩（到总体积1/3），将浓缩液移于50 mL的容量瓶加水定容至刻度,得样品溶液定量分析测定。

1.5 竹叶黄酮的纯化

1.5.1 乙酸乙酯萃取法

首先取100 mL定容液，用石油醚萃取3次（取下层溶液），将萃取液在70℃热水液上加热20～30 min。加热后的溶液再用乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯液（减压蒸去溶剂）浓缩液（到总体积1/3），浓缩后的溶液再用乙醇溶解过滤，最后用乙醇定容至50 mL，用于黄酮含量测定。

1.5.2 拌聚酰胺法

首先取50 mL定溶液，用石油醚萃取3次（取下层溶液），萃取得到的溶液在70℃热水液上加热，将加热后的溶液减压浓缩（到总体积1/3），然后在浓缩液中拌入聚酰胺静置20 min，接着将含黄酮的聚酰胺用95 % 的乙醇萃取至无黄酮，再对萃取溶液进行减压浓缩，最后定容至50 mL容量瓶，用于黄酮含量测定。

1.6 竹叶中黄酮的测定

1.6.1 对照品溶液的绘制

准确称取芦丁样品15 mg，放于10 mL量瓶，加入60 % 乙醇溶解并定容至刻度并摇匀，于4 ℃冰箱中保存。

1.6.2 标准曲线的制备

准确吸取对照品溶液0 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL， 分 别 置 于 10 mL量瓶中。每组对照品中分别加入0.25 mL 5 %NaNO2溶液放置3 min，接着加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并摇匀溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL并摇匀，放置10 min。并以去离子水作为参比，最后于510 nm波长处测定其吸光度。

1.6.3 黄酮含量的测定

准确吸取黄酮提取液1 mL，分别置于10 mL量瓶中。黄酮提取液中加入0.25 mL 5 % NaNO2溶液放置3 min，接着加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并摇匀溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL，摇匀，放置10 min。最后于510 nm波长处测定其吸光度，代入标准曲线方程求出竹叶黄酮提取液中黄酮的浓度。

1.7 不同提取方法总黄酮提取率比较

1.7.1 不同方法竹叶黄酮地提取

分别用去离子水作溶剂的微波提取法、60 %甲醇溶液作溶剂的超声提取法、回流提取法来提取竹叶中的黄酮。得到黄酮粗提取液后再经过减压蒸去溶剂浓缩溶液（到总体积1/3），将浓缩液转移到干锅中继续高温浓缩，直到溶液变为固体粉末，得到粉末状黄酮粗提物。

1.7.2 黄酮提取率的测定

总之，企业财务会计风险管理是企业生产运营过程中不可或缺的必要工作内容，对增强企业抵御风险的能力，提高企业财务管理水平等方面，有着十分重要的现实意义。因此，各个企业必须充分了解自身财务会计风险的类型，深刻认知财务会计风险管理中存在的问题，不断优化资产结构，完善内部控制制度，构建完善的风险监督体系，并建立健全风险评估机制，从而促进企业的健康可持续发展。

准确称取经不同提取方法（微波、超声、回流）提取得到的黄酮粗物3 mg，分别置于10 mL量瓶中，然后加入60 %乙醇溶解并定容到刻度，摇匀溶液。再用移液枪准确移取各黄酮样品1 mL，分别置于10 mL量瓶中，在各样品中分别加入0.25 mL 5 % NaNO2溶液放置3 min，接着加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并摇匀溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL并摇匀，放置10 min。最后于510 nm波长处测定其吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程求出竹叶黄酮粗提产品中黄酮的含量。

1.8 微波法提取竹叶总黄酮影响因素的研究

1.8.1 微波时间的影响

准确称取5 g竹叶粉，置于500 mL烧杯中，以水作为溶剂。按料液比为1 : 20的比例加入去离子水100 mL，将微波炉的微波功率调至400 w，根据微波时间的不同，样品分别在时间为1 min、2 min、3 min、4 min条件下进行竹叶中黄酮地提取。

1.8.2 微波功率的影响

准确称取5 g竹叶粉，置于500 mL烧杯中，以水作为溶剂。按料液比为1 : 20的比例加入去离子水100 mL，将微波作用时间调至2 min，根据微波功率的不同，样品分别在微波功率为100 w、200 w、300 w、400 w、500 w条件下进行竹叶中黄酮地提取。

1.8.3 固液比的影响

2 结果与分析

2.1 不同提取方法总黄酮的含量

2.1.1 标准曲线方程

本实验采用分光光度法测定竹叶中总黄酮的含量，就需要选则一个标准溶液，利用标准溶液做标准曲线，通过和标准曲线地对比计算其含量。此次实验以芦丁溶液为标准溶液绘制标准曲线。

以吸光度为纵坐标，以质量浓度为横坐标，得吸光度与浓度有很明显的线性关系。标准曲线方程：Y = 1.6678 X + 0.0070 R2= 0.9995

2.1.2 微波法提取竹叶总黄酮影响因素的结果

由图1知，黄酮的提取量随着提取时间增加而升高，但到3 min左右后，增加趋于平缓，并随着时间增加有下降趋势。可能是提取温度过高而破坏了黄酮的结构，使黄酮分解，由此得出微波时间最佳为3 min。

由图2知，随着微波功率地升高黄酮提取量也逐渐升高，当微波功率到达400 w时黄酮提取量达到最高，如果继续提高功率则黄酮的提取量将下降。由此得微波功率最佳为400 w。

由图3知，黄酮提取量随着竹叶与水溶剂比例的减小而增加，当固液比为1 ∶ 30时黄酮提取量达到最大，并随着比值的继续减小呈现出减小的趋势。由此得出固液比最佳为1 ∶ 30。

因此通过以去离子水作为溶剂的微波法提取竹叶总黄酮单因素实验条件的对比，最终得出最佳的提取工艺条件是：竹叶粉5 g、水为提取溶剂、固液比为1∶ 30、微波功率400 w、微波时间3 min。

2.2 不同提取方法的竹叶黄酮提取率（见表1）

竹叶总黄酮提取分别是微波法、超声法、回流法。经过对提取液进行分离和浓缩纯化后得粗提样品，并对三种不同的方法提取得到粗提样品进行总黄酮含量的测定比较。通过测得竹叶黄酮提取液的吸光度，将吸光度值带入方程Y = 1.6678 X + 0.0070可以算出竹叶中总黄酮的含量。

总黄酮提取率 = 提取液中总黄酮的含量 / 竹叶原料的重量 × 100 %

粗品中总黄酮含量 = 总黄酮的浓度 × 250 mL/原料重量

经实验研究对比表明：

一是以去离子水作为提取剂的提取方法中微波提取法（50 %）的提取率大于回流提取法（49 %）。

二是以去离子水作为提取剂的微波法和以60%甲醇作为提取剂的超声法的提取率比较得出两种方法的提取率只相差1 % 。

三是作为提取剂的比较，甲醇具有一定的毒性，同时挥发性强，市场价格较高，而去离子水无毒性，易得无挥发性，并且经济环保。作为提取方法对比，超声提取的过程时间一般为1 ～ 2 h，而微波提取的过程时间一般为20 ～ 30 min。

表1 不同提取方法的黄酮提取率比较

因此，实验研究对比得出：最快、最优、最经济环保实验条件为以去离子水作为提取剂的微波提取法。微波提取法是利用了微波能来提高竹叶黄酮提取效率的一种高新技术，与超声法、回流法相比较，具有设备简单、时间短、重现性好、提取效率高、经济环保等特点，达到强化与优化传热传质的目的。

3 结 论

首先，通过对不同溶剂（水、乙醇、甲醇）、不同提取方法（微波、超声、回流）地对比研究，找到了最佳的提取方法是以水作为溶剂的微波提取法。相比较其他方法具有提取率较高、时间短、实验简单环保的优点。其次研究了微波提取法中的单因素条件对竹叶总黄酮提取量的影响，分别对比研究了不同时间、不同功率、不同固液比条件下的总黄酮的提取量，表明实验条件是：3 min 为最佳条件的微波时间，最佳的固液比为1 ∶ 30，最佳微波功率为400 w 。