不同促生菌培养发酵分泌的激素和有机酸含量

舒健虹， 王子苑， 刘晓霞， 李亚娇， 王小利

(贵州省农业科学院 草业研究所， 贵州 贵阳 550006)

磷是植物生命过程最重要的矿物质元素之一，在植物的生长发育和生理代谢活动中起着重要作用[1]。缺少或缺乏磷素，作物不能正常完成其生活史。而植物只有在一个非常窄的土壤pH范围内才能够吸收利用磷素，在酸性土壤上，磷和铁、铝等金属元素形成难溶性化合物，在碱性土壤上，磷与钙、镁结合从而导致土壤中的总磷含量很高，而作物可利用的磷很少[2]。传统农业生产中大量施用磷肥，这不仅会导致环境破坏，还因为植物难以吸收利用造成环境的污染。因此，最有效环保的方法是筛选有益菌为植物生长提供磷源。

植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria， PGPR)是一类存在于植物根际和根表，具有固氮、解磷、产生植物激素等能力，是较好的有益菌群。PGPR中研究最多的是固氮菌和溶磷菌，溶磷菌和固氮菌是影响植物生长发育最重要的土壤微生物，有研究报道，溶磷菌能分泌甲酸、乳酸、丁二酸等多种有机酸促使磷源的转换供植物吸收利用[3-4]，Rs-5 菌株能够产生有机酸，菌株产生的柠檬酸和苹果酸对微生物解磷起主要作用[5]。固氮菌除有固氮功能，还可以促进植物根系的生长，将更多的水分及矿物质输送到植株地上部分，增加作物的产量[6]。

笔者前期用蛭石+磷矿粉作为基质的盆栽试验，施用相同处理的Hoagland营养液，在溶磷量差异较大的溶磷菌剂中加入固氮酶活性相同的固氮菌剂，其组合菌剂施入黑麦草根际后，黑麦草植株的磷含量无显著差异，但干重和植株氮含量差异均显著。许多学者对此类现象的产生进行了单一菌株分泌激素和有机酸的研究[7]。虞伟斌[8]认为，解磷菌假单胞菌K3主要代谢产物为苹果酸、乳酸和草酸，有机酸的螯合作用是解磷细菌K3 菌株解磷的主要机理。李宇博等[9]认为，微生物生长繁殖产生草酸为主的有机酸，降低环境的pH，促进难溶性磷的释放。但对组合菌剂的研究较少。从解磷机理角度加深对功能菌株的认识，充分发挥促生菌株的功能，筛选最佳组合菌剂，具有重要的现实意义。为此，笔者等对不同促生菌进行单株与组合培养，对其分泌激素和有机酸含量进行测定，探寻组合菌剂在激素和有机酸上影响的关键因子，以期为复合菌肥研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 试验所选用的菌种于2017年5-7月分别采自贵州省独山县、平塘县、三都县和罗甸县禾本科根际和豆科根际土壤，共分离筛选出48株菌种，用黑麦草作单株回接筛选和组合菌剂试验，把表现差异较大的2个组合菌剂的菌种进行培养试验。固氮菌C1分离自白茅根系，菌种特征为菌落透明细小水润；C2分离自禾本科野草根系，菌种特征为水润粘稠，边缘黄褐色；溶磷菌P1分离自葛藤根际土壤，菌种特征为白略透明，干燥；P2分离自白三叶根际土壤，菌种特征为乳白色粘稠。

1.1.2 培养基 促生菌分泌激素、有机酸培养基：1%植酸钙，2%葡萄糖，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%FeSO4·7H2O，0.001%MnSO4·H2O，2%琼脂粉，pH 7.0～7.5[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 在前期试验的15个组合试验中，选用对黑麦草产量和品质促生效果较好的P2+C1组合菌剂和促生效果不明显的P1+C2组合菌剂，进行单株和组合菌培养试验，将筛选出的4个菌株设为6个不同的组合处理，分别为C1、C2、P1、P2的单株培养和P2+C1、P1+C2的组合培养，各处理3次重复。将不同组合的菌株接种于促生菌分泌激素、有机酸培养基中培养，9 d后进行内源激素及有机酸含量的测定。

1.2.2 供试菌分泌内源激素及有机酸含量的测定 取培养9 d的菌液，冷却至4℃，于12 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液，用针头式过滤器滤膜(0.45 μm)过滤于带有内衬管的样品瓶内待测。参照郭敏敏等[12]试验方案，采用高效液相色谱法HPLC (Aglient 1260)测定内源激素〔赤霉素(GA3)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)〕。有机酸测定参照郭燕等[13-14]的试验方案进行。

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 18.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同促生菌分泌激素的含量

从表1看出，促生菌株没有产生脱落酸(ABA)，C1分泌的赤霉素(GA3)含量较C2增加82.97%，差异极显著，生长素(IAA)较C2增加1 895.16%，差异极显著；P1分泌的GA3较P2增加87.21%，差异极显著，IAA较P2增加126.74%，差异极显著；组合菌剂P2+C1分泌的GA3和IAA含量较P2菌剂高100.42%和51 329.51%，差异极显著，组合菌剂P1+C2分泌的IAA 和GA3含量较P1菌剂低24.81% 和51.45%，且GA3含量差异显著；分泌激素总含量依次为P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2。

表1 不同促生菌培养分泌激素的含量

注：同列不同大小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively. The same below.

2.2 不同促生菌分泌有机酸的含量

从表2看出，促生菌种分泌有机酸的种类和含量差异很大，菌株分泌总有机酸含量表现为组合菌剂的有机酸含量大于单一菌剂的含量，其总有机酸含量依次为P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。单一固氮菌剂C1分泌的草酸、甲酸、乳酸含量最高，分别为2.73 μg/mL、94.56 μg/mL和334.38 μg/mL。C2分泌的苹果酸、柠檬酸和丁酸含量最高，分别为58.30 μg/mL、12.93 μg/mL和56.14 μg/mL，总有机酸C1比C2增加30.23%，差异极显著；P1分泌乳酸、柠檬酸和丁酸含量分别比P2高6.09%、337.68%和651.04%，差异极显著，总有机酸P1比P2增加29.02%，差异极显著；组合菌剂P2+C1分泌的柠檬酸、苹果酸最高，分别为17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，为22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，为3.42 μg/mL，柠檬酸、苹果酸、甲酸次之，分别为8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其总有机酸含量依次为P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。组合菌剂P2+C1分泌的柠檬酸和苹果酸含量均高于单一菌剂的分泌量，差异极显著。P1+C2分泌的柠檬酸、草酸和苹果酸含量均高于单一菌剂的分泌量，差异极显著。菌株总有机酸分泌量P1>P2，与其溶磷能力相同。组合菌剂总有机酸P2+C1较P1+C2增加117.19%，差异极显著。

表2 不同促生菌培养分泌有机酸的含量

3 结论与讨论

植物激素能够普遍调控高等植物的生长发育。生长素是植物体内普遍存在的，也是最早被发现的一类植物激素[12]。IAA 可促进细胞和器官的生长，促进细胞的分裂，引起植物向地性和向光性反应，促进植物雌花分化，诱导单性结实等[13]。当生长素含量降低时植株生长就会受到一定的抑制[14]，在非生物胁迫时参与植物生长发育的调节作用[15]。GA3和IAA 的作用类似，只有在IAA存在的前提条件下GA3才能促进细胞的增大，有增效的作用[16]。赤霉素(Gibberellin，GA)和生长素已被证明在豌豆茎的伸长和单性结实上[17]、杨树侧根的发育[18]、拟南芥花序和根发育[19-20]等方面具有协同作用。试验中所用菌剂都分泌IAA和GA3，在组合菌剂中P2+C1的激素总含量最高，为155.781 μg/mL，P1+C2总含量最低，为3.967 μg/mL。可见当菌剂达到最佳组合时，其激素含量远远大于单一菌剂，这将有利于植物抵抗不利环境的生长和增加生物产量。

有机酸可以不同程度地降低土壤中Fe-P、A1-P 和Ca10-P，增加Ca2-P、Ca8-P含量，促进能力为草酸>柠檬酸>酒石酸[21]。研究认为，微生物风化磷矿石的机理主要是络合作用、酶解作用、酸化溶解及微生物自然生长的机械作用[22-25]。在磷胁迫条件下，柠檬酸、草酸、酒石酸能够降低土壤吸附磷的能力，达到解磷的效果[26]。试验中固氮菌剂分泌的甲酸和乳酸含量最高，草酸次之；溶磷菌剂分泌草酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸，但总有机酸量偏低；组合菌剂P2+C1分泌的柠檬酸、苹果酸最高，分别为17 856.58 μg/mL和283.71 μg/mL，甲酸次之，为22.93 μg/mL，P1+C2分泌的草酸最高，为3.42 μg/mL，柠檬酸、苹果酸、甲酸次之，分别为8 314.81 μg/mL、70.72 μg/mL和28.13 μg/mL，其总有机酸含量依次为P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2。分泌有机酸是溶磷微生物溶磷的重要途径之一，但并不是溶磷微生物解磷的唯一的途径。李小冬等[27]采用转录组学解析了白三叶根际溶磷菌株 RW8的溶磷机制发现，菌株生物学过程主要聚类在代谢过程、细胞过程、单细胞过程、刺激应答、定位以及生物反应调节；细胞组分主要聚类在细胞组分、细胞膜、膜组分与高分子配合体等；分子功能主要聚类在催化活性、结合功能与转运功能，可见溶磷微生物的溶磷过程非常复杂，而不是单一的生物学过程。所以还应开展菌株与环境及寄主之间的溶磷性研究。

促生菌分泌激素组合含量依次为P2+C1>C1>P1>C2>P2>P1+C2，组合菌剂分泌的激素并不是简单的叠加效应，当组合达到最佳效应时激素的分泌量才能增加。组合菌剂总有机酸含量依次为P2+C1>P1+C2>C1>C2>P1>P2，但分泌有机酸并不是溶磷微生物解磷的唯一途径，还应考虑环境因子及寄主对促生菌生长解磷的影响，才能达到植物抗逆增产的作用，试验中P2+C1是较优组合菌剂。在菌肥的研制上不能简单的采用叠加方法处理，必须开展大量的组合试验筛选最佳组合菌剂。