黑果小檗总花色苷对β-淀粉样蛋白致阿尔茨海默病大鼠的改善作用

迪娜·吐尔洪， 康莹莹，阳 莹， 李建光

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)又称老年痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型[1]。其主要病理变化为以β-淀粉样蛋白为主要成分的老年斑大量沉积、神经纤维缠结以及神经元变性丢失，同时伴有弥漫性大脑皮层萎缩[2-4]。黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)为小檗科小檗属落叶灌木，主要生长于我国新疆天山南北部[5]。研究发现，黑果小檗果实中的花色苷主要含有翠雀素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、以及锦葵素-3-O-葡萄糖苷5种成分[6]，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物学活性[7]，临床上可用于亨廷顿病、局部缺血性脑卒中、高血压、非酒精性脂肪性肝炎等多种疾病的治疗[8-9]。研究显示花色苷可以有效改善AD大鼠的认知和运动能力[10]，但关于黑果小檗总花色苷(BTA)应用于AD的研究少有报道。本研究采用Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病(AD)模型大鼠，探究BTA对Aβ25-35致AD大鼠认知功能的影响，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器TM-Vision行为学实验系统(成都泰盟科技有限公司)；DHP-360型电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；AB104-N型电子天平(梅特勒-拖利多仪器有限公司)；5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；HH-S4型数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；M568E型尼康正置显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 试药Aβ25-35(美国Sigma公司，批号A0322A)；盐酸多奈哌齐片(日本卫材药业有限公司，批号1702012)；BCA蛋白定量试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司，批号18Ba0501)；高效RIPA组织/细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号20190723)；苏木素染色液(北京九州柏林生物科技有限公司，批号20180706)；二甲苯(天津市富宇精细化工有限公司，批号070210)；中性树脂(上海源叶生物科技有限公司，批号Z09F8Y29094)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K172320B)；免疫组化兔二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号18112A11)。

1.3 药材黑果小檗于2017年9月采自乌鲁木齐市南山山区，经新疆维吾尔自治区中药民族药研究所贾晓光研究员鉴定为小檗科小檗属植物黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)的果实，经本实验室前期提取纯化后得到BTA含量为39.28 %的冻干粉末。

1.4 实验动物健康SPF级SD大鼠72只，雄性，体质量(180±20)g，购自新疆医科大学动物实验中心，生物生产许可证号：SCXK(新)2016-0003，质量合格证号：65000700000904，实验动物在恒温、适宜湿度的条件下，自由进食、饮水适应性饲养。

2 方法

2.1 造模方法[11]将Aβ25-35用无菌生理盐水稀释成2 μg/μL的溶液，放在37℃恒温箱中，孵育7 d，备用。用2.5%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠(0.3 mL/100 g体质量)，剃去颅顶的毛，沿颅顶正中剪开约1 cm的小口，暴露前囟，注射位置为前囟后3 mm，正中矢状缝左右旁开2 mm，进针深度4 mm，用针头在颅骨表面分别钻孔，用微量注射器分别在模型组、给药组大鼠两侧海马注射凝聚态Aβ25-35各5 μL，假手术组大鼠按照以上方法注射等量生理盐水后，缝合各组大鼠头皮，用碘伏进行消毒。

2.2 动物分组及给药将72只SD雄性大鼠，随机分为6组，每组12只，分别为假手术组(双侧海马注射生理盐水+灌胃给予生理盐水，1mL/kg体质量)、模型组(双侧海马注射Aβ25-35+灌胃给予生理盐水，1 mL/kg体质量)、BTA高剂量组(双侧海马注射Aβ25-35+灌胃给予BTA 218.6 mg/kg,1 mL/kg体质量)、BTA中剂量组(双侧海马注射Aβ25-35+灌胃给予BTA 109.3 mg/kg,1 mL/kg体质量)、BTA低剂量组(双侧海马注射Aβ25-35+灌胃给予BTA 54.6 mg/kg,1 mL/kg体质量)、阳性对照组(双侧海马注射Aβ25-35+灌胃给予多奈哌齐0.8 mg/kg,1 mL/kg体质量)。各组动物于造模后按要求给药，1次/d，连续28 d。

2.3 观察指标

2.3.1 大鼠行为学测试[12](1)定位航行:将大鼠随机从4个象限面朝池壁放入水中，当大鼠找到站台，在站台上停留超过3 s则实验结束，这段时间称为逃避潜伏期，同时记下大鼠在120 s内找到水下站台的时间(s)。若大鼠在120 s内没有找到站台，则该次逃避潜伏期记为120 s，随后将其引导至站台适应10 s，定位航行训练持续5 d，记录逃避潜伏期。(2)空间探索: 在定位航行训练的第6 d，移除水下站台，并将大鼠从站台的对侧象限入水，记录大鼠在60 s内的穿越平台次数，即经过原平台位置的次数。

2.3.2 大鼠大脑重量测得定 实验结束后每组随机取6只大鼠，腹主动脉取血后脱颈椎处死，取出大脑，称重，计算脏器系数=脏器重量/体质量×100%，标记后将其装入冻存管，置液氮快速冷冻，最后保存在-80℃冰箱中备用。

2.3.3 大鼠脑组织HE染色 取每组剩余的6只大鼠腹主动脉取血，暴露胸腔，以止血钳夹闭胸主动脉，分别用0.9%生理盐水以及4%多聚甲醛进行灌注，结束后取出脑组织，从大鼠的脑视神经交叉根部与四叠体之间，切得脑片，厚度3～4 mm，置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后连续冠状切片，厚度为3 μm，将石蜡切片经苏木素-伊红染色后，脱水透明后封片，观察锥体细胞的形态学变化。

2.3.4 免疫组化 石蜡切片通过脱腊水化，抗原修复，滴加内源性过氧化物酶，滴加一抗Aβ25-35(1∶50)，滴加酶标山羊抗兔IgG聚合物，DAB显色后，苏木素染色，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，经脱水透明后封片，观察大鼠脑组织中锥体细胞中Aβ25-35的表达情况。

3 结果

3.1 定位航行实验结果与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期较长，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，BTA高、中、低剂量组和阳性对照组大鼠的逃避潜伏期缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

a: 假手术组运动轨迹图

b: 模型组运动轨迹图

c: BTA高剂量组运动轨迹图

d: BTA中剂量组运动轨迹图

e: BTA低剂量组运动轨迹图

f: 阳性对照组运动轨迹图

图1 各组大鼠第5天定位航行实验轨迹图

图2 各组大鼠逃避潜伏期的比较

3.2 空间探索实验结果与假手术组比较，模型组大鼠穿越平台次数减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，BTA高、中剂量组和阳性对照组大鼠穿越平台次数增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，BTA低剂量组大鼠穿越平台次数增多，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

表2 各组大鼠穿越平台次数的比较 次)

注：与假手术组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05。

3.3 大鼠脑质量变化情况与假手术组比较，模型组大鼠大脑质量减轻，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，BTA高、中、低剂量组和阳性对照组的大鼠大脑质量增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

a: 假手术组运动轨迹图

b: 模型组运动轨迹图

c: BTA高剂量组运动轨迹图

d: BTA中剂量组运动轨迹图

e: BTA低剂量组运动轨迹图

f: 阳性对照组运动轨迹图

图3 各组大鼠空间探索实验轨迹图

表1 各组大鼠大脑的脏器系数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.4 HE染色结果光镜下观察大鼠海马组织CA1区病理学变化：假手术组海马CA1区锥体细胞形态结构完整，排列紧密整齐，轮廓清晰，细胞核圆，有明显核仁，胞浆丰富，神经元数目分布均匀，染色正常；与假手术组比较，模型组海马CA1区锥体细胞形态和结构改变较明显，排列稀疏紊乱，可见胞核固缩，胞浆与胞核界限不明显，染色加深，数量明显减少，出现神经元萎缩现象，部分胞核消失，形成空泡状结构；与模型组比较，BTA高剂量组及阳性对照组海马CA1区锥体细胞形态结构和数量均有不同程度的恢复,其细胞排列较紧密整齐,数量增多,形态较正常；BTA中、低剂量组椎体细胞形态结构异常情况有所改善,数量增加,大部分核染色正常。表明BTA可以有效改善AD模型大鼠海马CA1区椎体细胞的结构异常,对海马神经元损伤具有一定的保护作用,见图4。

a: 假手术组

b: 模型组

c: BTA高剂量组

d: BTA中剂量组

e: BTA低剂量组

f: 阳性对照组

图4 各组大鼠海马CA1区HE染色结果(400×)

3.5 各组大鼠海马CA1区Aβ25-35蛋白表达结果Aβ25-35蛋白主要表达于海马CA1区锥体细胞的细胞质，少数表达于轴突，阳性反应呈现棕黄色。假手术组中呈现少量Aβ25-35蛋白表达；与假手术组比较，模型组海马CA1区阳性反应增强，细胞质内可见黄色颗粒聚集，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，BTA高、中剂量组及阳性对照组海马CA1区的阳性反应降低，差异有统计学意义(P<0.05)，BTA低剂量组海马CA1区的阳性反应降低，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图5。

a: 假手术组

b: 模型组

c: BTA高剂量组

d: BTA中剂量组

e: BTA低剂量组

f: 阳性对照组

图5 各组大鼠海马CA1区Aβ25-35蛋白的表达(400×)

表3 各组大鼠海马CA1区Aβ25-35蛋白的表达

注：与假手术组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05。

4 讨论

目前大部分靶向 Aβ 临床药物试验结果都不理想[13]，但Aβ学说仍是AD研究领域的热点。国内自主研发的抗 AD 药物甘露寡糖二酸已完成了Ⅲ期临床试验[14]，在分析总结后，多种药物也陆续进入Ⅲ期临床试验阶段。本研究通过分析各组大鼠大脑脏器系数结果发现模型组大鼠的大脑质量减轻，大鼠出现脑萎缩情况，而BTA对这一现象有明显的改善作用。通过HE染色观察各组大鼠脑组织海马的形态变化，发现各给药组大鼠海马CA1区异常病理结构出现不同程度的恢复，提示BTA可有效改善AD模型大鼠海马的病理性损伤。记忆力和认知功能障碍为AD的主要临床表现[15]。Aβ为老年斑的主要成分，Aβ的清除减慢使游离Aβ增加，超过临界浓度时，Aβ就会聚集沉积，脑内Aβ不断积聚被认为是导致神经毒性的致病因素之一[16]。免疫组化结果显示，与模型组比较，不同浓度给药组大鼠海马CA1区Aβ25-35蛋白表达水平均降低。综上所述，BTA可改善Aβ25-35诱导AD模型大鼠的认知能力及脑组织病理结构，可能是通过减少Aβ25-35蛋白的表达水平有关，BTA高剂量组的改善作用与阳性药多奈哌齐相当，其具体作用机制仍需进一步研究。