细粒棘球绦虫原头蚴葡萄糖摄取检测方法的建立

库尔班尼沙·阿马洪， 李锦田， 刘 辉， 吕国栋， 田春艳， 赵 军， 王建华

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院临床医学研究院，省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，3第一附属医院药学部临床药学科， 乌鲁木齐 830054)

囊型包虫病(Cystic echinococcosis，CE)是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，E.granulosus)引起的，全球广泛分布的一种被忽视的寄生虫病[1-2]。这种疾病在全球范围内广泛分布，中亚国家和中国是高发区[3-4]。CE影响全球超过100万人，中国西部一些畜牧业地区患病率达到10%左右。每年经济负担超过30亿美元的费用[5]。目前，CE的治疗手段主要是手术和化疗。但是手术治疗后易导致术后的复发或继发感染。需在手术治疗之外，辅以抗包虫药物治疗。迄今为止，仅有2种获批药物阿苯达唑和甲苯达唑[6]。阿苯达唑和甲苯达唑存在药物吸收率底和副作用诸多等问题，因此亟需研发新的抗包虫药物靶点和药物分子[7]。

糖代谢通路是目前筛选治疗包虫病药物分子的热门靶点之一, 糖代谢通路对E.granulosus寄生和存活至关重要。Loos等[8]研究发现二甲双胍通过抑制E.granulosus糖代谢通路，来降低细粒棘球绦虫原头蚴(Echinococcusgranulosusprotoscoleces，EgPSCs)的活性。辛奇[9]发现已糖激酶抑制剂3-溴丙酮酸体内体外有很好的抗包虫作用。已有研究发现E.granulosus具有完整的糖代谢通路，糖代谢通路对E.granulosus在宿主体内寄生和存活中起重要作用，葡萄糖摄取是糖代谢通路的重要步骤之一，但其如何从中间宿主摄取葡萄糖的机制尚不清楚[10-11]。研究其葡萄糖摄取能力，对于全面阐明E.granulosus的糖代谢机制是一个重要的补充。由于尚无检测E.granulosus葡萄糖摄取的方法，本研究拟建立了EgPSCs的葡糖摄取的检测方法,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器DMEM细胞培养基、胎牛血清、1640培养基、双抗和0.25%胰蛋白酶均购自于Gibco公司，PBS 购自于Hyclone公司，MTT购自于BioFROXX公司, 2-(N-7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)购自于Invitrogen公司，WZB117购自于上海瀚香生物科技公司，37℃ 细胞培养箱和荧光酶标仪均购自于Thermo公司，美国。

1.2 细胞培养HepG-2细胞购自湖南丰晖生物科技有限公司。使用含10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中培养 HepG-2细胞，放置于 37℃ 恒温培养箱中贴壁培养，待细胞汇合度达到80～90%，以0.25%的胰蛋白酶消化(每隔 3～5 d，按 1∶3 比例进行细胞传代)接种于96 孔板。

1.3 细粒棘球蚴绦虫原头蚴从新疆乌鲁木齐华凌屠宰场以自然细粒棘球蚴感染的绵羊肝脏中无菌条件下获得EgPSCs。

2 方法

2.1 细胞增殖(MTT)实验将HepG-2细胞每孔5×104个细胞密度的接种于96孔板，置37℃含5%的CO2的培养箱中贴壁生长，待HepG-2细胞长到80～90%时分别用不同浓度的WZB117(0、1、10和30 μmol/L)干预24 h。每孔加入10%的MTT(5 mg/mL)，孵育4 h，弃掉上清液，加150 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪450 nm波长检测吸光度，空白调整，通过与0 μmol/L浓度比较得到干预后的存活率，各浓度实验重复3次。

2.2 HepG-2细胞葡萄糖摄取检测通过测量2-NBDG的摄取来分析WZB117对HepG-2细胞葡萄糖摄取的抑制作用。将HepG-2细胞每孔以5×104个细胞密度的接种于96孔板，置37℃含5%的CO2的培养箱中贴壁生长24 h。HepG-2细胞每孔WZB117不同浓度(0、1、10、30 μmol/L)。干预24 h，每孔加入100 μmol/L浓度的 2-NBDG[12]，各浓度均于37℃ 培养箱内孵育0、60、90、120 min，弃上清，PBS 清洗2次,荧光酶标仪检测荧光强度条件，激发波长为466 nm，发射波长为540nm。各浓度实验重复3次。

2.3 EgPSCs葡萄糖摄取检测按照每孔250～300头原头蚴，200μL液体培养基进行实验，各组均做3个平行复孔。各孔均加入198 μL的含10%FBS的1 640培养基和2 μL不同浓度的WZB117(终浓度为0、1、10、30 μmol/L)，孵育24 h。各组均加入终浓度100 μmol/L的2-NBDG，分别于37℃培养箱内孵育0、60、90、120 min，弃上清。PBS 清洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度条件，激发波长为466 nm，发射波长为540 nm。各浓度实验重复3次。

3 结果

3.1 WZB117抑制HepG-2细胞的增殖不同浓度的WZB117(1、3、10和30 μmol/L)均能显著降低HepG-2细胞的增殖活性(P<0.05),呈剂量依赖效应(图1)。

注: 与0 μmol/L溶剂相比,*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。

图1 不同浓度WZB117处理24h后HepG-2的存活率

3.2 建立HepG-2细胞的葡萄糖摄取方法采用0、1、10和30μmol/L4个不同浓度的WZB117干预HepG-2细胞24 h，再100 μmol/L 2-NBDG干预60 min，发现2-NBDG的摄取量随浓度升高而降低。30 μmol/L WZB117能显著抑制HepG-2的葡萄糖摄取能力(43.31±10.23 )%，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

将30 μmol/L WZB117干预HepG-2细胞24 h，再加入2-NBDG，分别孵育0、60、90、120 min，检测葡萄糖摄取。发现2-NBDG孵育60、90、120 min，30 μmol/L WZB117均能显著抑制HepG2细胞的葡萄糖摄取能力。2-NBDG孵育90 min检测WZB117对HepG2细胞葡萄糖摄取能力的条件最佳(图3)。

注: 与0 μmol/L溶剂相比, ***P<0.000 1。

图3 2-NBDG孵育不同时长对 30μmol/L WZB117干预HepG-2细胞的葡萄糖摄取能力的影响

3.3 建立EgPSCs的葡萄糖摄取方法采用不同浓度的WZB117(0、1、3、10、30 μmol/L)干预EgPSCs 24 h，再用100 μmol/L 2-NBDG孵育60 min，发现0、 1、3、10、30 μmol/L不同浓度WZB117均能显著抑制EgPSCs的葡萄糖摄取能力，差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。将30 μmol/L WZB117体外干预EgPSCs 24 h，再摸索2-NBDG的最佳孵育时间。发现2-NBDG孵育60 min就能检测到30 μmol/L WZB117 对 EgPSCs 的葡萄糖摄取能力的抑制作用(图5)。

注: 与0 μmol/L溶剂相比, **P<0.05。

图5 30 μmol/L WZB117干预EgPSCs后不同时间的2-NBDG摄取量

3 讨论

葡萄糖摄取是E.granulosus保证生存的基本功能，是研发治疗包虫病的重要靶点。然而，目前尚无检测E.granulosus的葡萄糖摄取的方法，本研究通过借鉴肿瘤细胞的葡萄糖摄取检测方法，建立了针对EgPSCs的葡萄糖摄取的检测方法。

2-NBDG是检测葡萄糖摄取的标志物，代谢途径与D-葡萄糖相似[13-14]，2-NBDG通过葡萄糖转运体(GLUT)进入细胞，并在C-6位置被己糖激酶I-II(HK)磷酸化[14]。磷酸化的荧光代谢物2-NBDG-6-磷酸残留在细胞中，直到进一步分解成非荧光形式[15]。它迅速的被肿瘤细胞吸收可以作为监测恶性肿瘤细胞葡萄糖摄取的敏感探针[14]。Cai等[16]研究证明2-NBDG在临床上可作为高代谢循环乳腺癌细胞荧光成像的示踪剂。已有研究发现把2-NBDG作为荧光标志物来检测肾细胞葡萄糖的转运[17-18]。Langsner等[19]证明2-NBDG具有作为光学造影剂的潜力，以区分癌症与非癌组织。吕良等[20]用2-NBDG作为检测肝癌HepG-2细胞葡萄糖摄取的探针指示剂。Tsytsarev等[21]用2-NBDG荧光成像监测脑葡萄糖代谢。Qiu等[22]用2-NBDG研究茶黄素A和茶黄素B对大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响。

为了建立EgPSCs的葡萄糖摄取的方法，本课题组先建立了HepG-2细胞的葡萄糖摄取检测方法。根据在肝癌[12]、肺癌[23]、心肌细胞[24]和乳腺癌细胞[25]中的研究，均使用终浓度100 μmol/L的2-NBDG孵育60 min后检测葡萄糖摄取。本研究显示,采用该条件成功建立了检测HepG2细胞的葡萄糖摄取的检测方法。另外本研究发现WZB117可以抑制HepG-2的细胞活性和细胞葡萄糖摄取，提示其可用于研发抗肝癌的药物分子。

本研究发现100 μmol/L的2-NBDG孵育EgPSCs 60 min后，采用激发波长466 nm，发射波长540nm的实验条件，可以检测EgPSCs的葡萄糖摄取。2-NBDG孵育EgPSCs 60 min和90 min均能达到相似的检测葡萄糖摄取的结果，因而选择孵育60 min为最佳时间。在此基础上，本研究发现WZB117可以高效的抑制EgPSCs葡萄糖摄取的能力，提示其可以作为阻断EgPSCs摄取宿主葡萄糖的药物，为进一步研究WZB117作为治疗包虫病的药物分子和WZB117靶向的蛋白作为药物靶标，奠定了前期工作基础。

综上所述，本研究建立了采用2-NBDG荧光类似物检测EgPSCs葡萄糖摄取的方法,为研发靶向葡萄糖代谢的治疗包虫病新药研发提供了一种新的实验方法。